蚝豉样品中N-亚硝胺类化合物检测方案(气质联用仪)

应用简报 Agilent食品安全Trusted Answers 使用 Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统对食品中的N-亚硝胺类化合物进行测定 袁智泉，冯爽，吴霞安捷伦科技(中国)有限公司 本文介绍了使用 Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统 (GC-MS/MS)分析食品中N-亚硝胺类化合物的方法。该方法采用 Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品进行前处理，使用多模式进样口 (MMI) 溶剂放空模式直接进样5uL，目标化合物在 0.1-10 ug/L 的范围内具有良好的线性。在实际海鲜干制品的分析中，回收率在81%-117%的范围内。该方法样品前处理简单、耗时短且灵敏度和回收率高，适用于分析食品中的N-亚硝胺类化合物。 食品中天然存在的N-亚硝胺类化合物含量极微，但其前体物质亚硝酸盐和胺类广泛存在于自然界中，在适宜的条件下可以形成 N-亚硝胺类化合物。N-二甲基亚硝胺(NDMA)是N-亚硝胺类化合物中的一种，具有肝毒性和致癌性，是国际公认的毒性较大的污染物。NDMA 广泛存在于各种奄制、熏烤肉制品和热加工食品中，长期食用此类食品会对健康产生潜在危害。因此，我国《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)对N-二甲基亚硝胺的含量限值有相应的规定。 但是，食品基质中含有大量的油脂和蛋白，这些物质随N-亚硝胺类物质一起提取时会对后续的仪器分析造成极大干扰，因而在样品前处理中去除食品基质中的脂质干扰尤为重要。现行标准方法中规定的食品中N-亚硝胺类化合物的测定方法是使用水蒸气蒸馏法对样品进行前处理，然后用气相色谱质谱联用仪进行分析。虽然水蒸气蒸馏法提取出的油脂较少，但是该方法需要几十甚至上百克样品量，某些干制品(特别是价值较高的海鲜制品)可能存在难以取样的问题。另外，该方法要使用大量的 有机溶剂进行萃取，然后浓缩至一定体积，样品前处理过程耗时长，且容易产生乳化和过度蒸发等问题，造成强挥发性 N-亚硝胺的回收率偏低和不稳定。 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品是一种新型吸附剂材料，能够选择性去除样品中的主要脂类而不损失分析物，相比传统的样品前处理技术具有快速、简单、回收率高等突出优势。肉类和海产样品基质复杂，使用气质联用系统在选择离子监测 (SIM)模式下检测此类样品中的N-亚硝胺化合物 时，可能因为基质干扰而出现假阳性或假阴性结果。利用三重四极杆气质联用系统在多反应监测(MRM)模式下可以去除基质干扰，提高方法的选择性和灵敏度。 本应用简报介绍了使用 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 对高蛋白、高脂肪的蚝豉样品进行前处理，使用安捷伦多模式进样口(MMI)在溶剂放空模式下进样5uL， 并采用 Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统全面分析样品中的九种N-亚硝胺类化合物(目标化合物及两种内标的信息见表1)。 编号 中文名称 英文名称 CAS 简写 1 N-二甲基亚硝胺 N-Nitrosodimethylamine 62-75-9 NDMA 2 N-甲基乙基亚硝胺 N-Nitrosomethylethylamine 10595-95-6 NMEA 3 N-二乙基亚硝胺 N-Nitrosodiethylamine 55-18-5 NDEA 4 N-二丙基亚硝胺 N-Nitrosodi-n-propylamine 621-64-7 NDPA 5 N-二丁基亚硝胺 N-Nitrosodi-n-butylamine 924-16-3 NDBA 6 N-亚硝基哌啶 N-Nitrosopiperidine 100-75-4 NPIP 7 N-亚硝基吡咯烷 N-Nitrosopyrollidine 930-55-2 NPYR 8 N-亚硝基吗啉 N-Nitrosomorpholine 59-89-2 NMorPh 9 N-二苯基亚硝安 N-Nitrosodiphenylamine 86-30-6 NDPhA IS N-二甲基亚硝胺-d6 N-Nitrosodimethylamine-d6 17829-05-9 NDMA-d6 IS N-二丙基亚硝胺-d14 N-Nitrosodi-n-propylamine-d14 93951-96-3 NDPA-d14 试剂和样品 本研究中使用的N-亚硝按类标准品及内标均购自美国AccuStandard，乙腈(质谱纯)购自 JT Baker。样品购自本地海产市场。 仪器和设备 本实验使用 Agilent 9000 气相色谱系统和7000D 三重四极杆气质联用系统，该仪器系统配备多模式进样口(MMI) 和Agilent 7693A 自动液体进样器。 样品前处理材料： Agilent Bond Elut EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管(部件号5982-1010) 和 Agilent Bond ElutEMR-Lipid Polish 反萃管(部件号5982-0101)。 标准溶液的配制 使用乙腈将N-亚硝胺类及其内标物混合并配制成0.1-10 ug/L的校准标样，内标浓度为10 ug/L， 进样至 GC-MS/MS 进行分析，并通过内标法进行定量。 样品前处理 使用乙乙提取， EMR-Lipid 分散固相萃取净化，详细的样品前处理流程见图1。移取10g样品加入10 mL乙腈中振荡提取，离心后取上层乙腈提取液加入 EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管中，振荡离心后，将上清液倒入 EMR-Lipid Polish 反萃管中，以去除多余水分并改善分析物分配。再次振荡离心后，取1mL上清液过有机相滤膜后，进样至 GC-MS/MS 进行分析。在食品中亚硝胺类化合物的分析中，传统的样品前处理方法采用蒸馏提取，并通过液液萃取净化后再水浴浓缩。该方法取样量大(200g)，有机溶剂消耗量多，每处理一个样品需要使用250 mL二氯甲烷，耗时约3小时，且比较难以实现样品的批量处理。而本文所述的 EMR-Lipid 样品前处理流程简单，每个样品取样量低(10g)，适用于分析价值高、难以大量取样的食品样品。整个流程简单、易操作，每个样品只需消耗 10 mL乙腈，且其中不含溶剂浓缩过程， 1小时内可以处理约6个样品。 图1.样品前处理流程 气相色谱条件 ( 色谱柱： Agilent HP-INNOWax毛细管柱，30mx0.25mm，0.25um 进样口衬管：单锥形不分流超高情性衬管，带玻璃毛(部件号 5190-2293) ) 进样体积：5.0pl 载气：氦气，恒定流速， 1.0 mL/min ( 进样口温度：程序升温，初始温度60℃，保持0.16 min，以 900℃ /min 的速率升至220℃ ) ( 进样方式：大体积进样(溶剂放空模式)；利用溶剂排除计算器得到进样参数(见图2和图3)，其中进样速率：32uL/min； 放空流量： 90mL/min；放空压力：5 psi；放空时间： 0.16min 升温程序：40℃下保持 0.5 min， 以15℃ /min 的速率升至190℃， 再以40℃ /min 的速率升至250℃，保持3 min ) 溶剂延迟：5.5min 离子化方式：El 离子源温度：250C 四极杆温度：150℃ 接口温度：250℃ 检测模式： MRM/(离子对信息见表2) 增益因子：1 定量方法：内标法，各化合物定性定量离子对见表2 表2.N-亚硝胺类目标物及内标的保留时间和 MRM 离子对信息 化合物 保留时间(min) 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量(V) NDMA 6.579 74 44 3 74 42 19 NMEA 6.947 88 71 2 88 42 17 NDEA 7.188 102 85 2 102 44 11 NDPA 8.297 130 113 1 130 43 9 NDBA 9.761 116 99 2 116 74 8 NPIP 10.055 114 84 5 114 41 13 NPYR 10.283 100 55 5 100 43 9 NMorPh 10.665 116 86 1 116 56 11 NDPhA 14.388 169 168 17 169 167 30 NDMA-d6 6.573 80 50 5 80 46 22 NDPA-d14 8.237 144 50 11 144 126 1 结果与讨论 MMI多模式进样口(大体积进样) 大体积进样(LVI)技术是改善痕量分析的最简单直接的方法。在系统中引入更多的样品，使到达检测器的分析物的含量成比例地增加，[由此可以得到更大的峰面积和峰高，实现更低的系统检测限。LVI的进样量可以从几微升到1毫升，甚至更大。样品溶剂在分析物转移至分离柱之前挥发而从系统中除去。LVI 的高灵敏度能够省去样品前处理时的样品浓缩过程，或减少预处理的样品量。 安捷伦多模式进样口 (MMI)使用与标准分流/不分流进样口相同的衬管和消耗品，可兼容现有的热分流和不分流方法。其进样模式包括：热分流/不分流((以及脉冲模式)、冷分流/不分流(以及脉冲模式)、溶剂放空和直接进样，其中溶剂放空模式适用于实现大体积进样。在溶剂放空模式下，进样口在样品注射过程中保持在较低的初始温度，进样口处于分流模式下，气化溶剂通过分流出口排出。一旦完成所有样品的进样，进样口就切换至不分流模式，然后快速加热进样口，将衬管中浓缩的分析物闪蒸并转移到色谱柱。在样品注射和溶剂放空期间，GC柱温箱一直保持在适当的温度，以保证分析物在色谱柱头再聚焦，之后柱温箱进行程序升温以实现分离3 可使用软件中集成的““Agilent 溶剂排除向导“工具对大体积进样的参数进行优化(见图2和图3)。在该工具的第一个界面上，需要输入样品溶剂、期望的进样量以及最早流出的分析物的沸点数据(图2)。该向导工具将计算初始进样口温度以及溶剂排出速率等参数(如图3)并下载到方法中。图4比较了1.0 ug/L 标准溶液在不分流模式下进羊1 uL与溶剂放空模式下进样5 uL所得到的响应。结果显示，在溶剂放空模式下采用5 uL的进样量明显改善了分析物的仪器响应。 图3.计算器根据所选进样口温度和放空流速计算进样速率和放空时间 图4.不同进样模式下得到的色谱图的叠加(坐标刻度一致) 色谱柱选择 亚硝胺化合物具有强极性和强挥发性，在低极性或中等极性色谱柱上保留时间较短且容易拖尾，在食品基质中更容易受干扰物质的影响。图5比较了沸点最低的亚硝胺安合物NDMA在不同色谱柱上的保留时间和峰形，最终选用了国标GB5009.26-2016推荐的 HP-INNOWax 色谱柱对 N-亚硝胺类物质进行分析。所有目标物均在 15 min 内流出，最先出峰的N-二甲基亚硝胺的保留时间也在6 min 之后，峰形对称且不易受到基质干扰。 图5.NDMA 在不同色谱柱上的保留时间及峰形 线性、精密度及检测限配制浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、10 ug/L的N-亚硝胺化合物的混合标准溶液，绘制五点校准曲线。利用内标法进行定量分析。所得到的九种目标化合物的线性和检测限见表3，所有目标化合物均具有优异的线性相关性，相关系数R²高于0.999。取0.1 ug/L 和 0.2 ug/L 混合标准溶液分别连续进样8次进行精密度测试，结果同样如表3所列。从中可以看出，采用5uL 进样量获得的结果具有良好的重现性， 0.1 ug/LN-亚硝胺化合物响应的相对标准偏差(RSD)<9.8%(各种化合物的定量、定性离子对结果见图6)， 0.2 ug/L目标化合物的响应 RSD <5.8%。使用该结果计算出九种N-亚硝胺类化合物的检测限(IDL) 低于 0.03 ug/L (取两个浓度下计算出的较大值)，远远优于国标方法的要求(0.3 ug/kg)，表明该方法的灵敏度极高。 图6.线性最低浓度 0.1 ug/L 下各种化合物的定量、定性离子对结果 表3.N-亚硝胺化合物及内标的线性、精密度和检测限结果(n=8) 表4.蚝豉样品在不同浓度下的加标回收率平均值与相对标准偏差 (RSD) (n =3) 化合物 R2 (0.1-10 pg/L) RSD% (0.1pg/L) RSD% (0.2 pg/L) IDL (ug/L) NDMA 0.9998 9.1 3.3 0.03 NMEA 0.9999 5.5 2.9 0.02 NDEA 0.9999 3.8 3.5 0.02 NDPA 0.9999 7.5 3.9 0.02 NDBA 0.9993 3.4 4.5 0.03 NPIP 0.9999 5.6 3.8 0.02 NPYR 0.9996 9.8 5.2 0.03 NMorPh 0.9998 8.6 4.0 0.02 NDPhA 0.9998 6.4 5.8 0.03 化合物 1.0 pg/kg 4.0 pg/kg 10 pg/kg 回收率% RSD % 回收率% RSD % 回收率 % RSD% NDMA 89.4 10.5 103.0 6.6 99.6 8.6 NMEA 84.2 1.5 102.9 1.5 106.5 1.9 NDEA 93.0 6.7 109.9 2.4 110.7 1.2 NDPA 87.9 7.5 104.2 12.1 117.4 4.1 NDBA 106.0 1.9 107.5 6.5 112.7 2.5 NPIP 96.3 11.7 105.5 9.8 93.1 12.6 NPYR 82.9 8.6 87.2 12.3 111.8 7.0 NMorPh 102.4 2.9 111.0 6.4 105.1 8.9 NDPhA 81.3 5.0 106.0 11.9 86.8 13.8 实际样品加标测试结果 本应用简报以蚝豉样品为例，依照图1所示的流程进行前处理，对N-亚硝胺类化合物进行加进测试。根据 GB 2762-2017的规定，水产动物及其制品中N-二甲基亚硝胺的限量值为4 ug/kg。因而对蚝豉样品进行三个不同浓度的加标：1.0 ug/kg、4.0 ug/kg 和10 ug/kg， 每个浓度下平行处理三份样品。图7显示了加标浓度为1.0 pg/kg 的九种N-亚硝胺化合物的MRM 谱图。从中可以看出，各种目标化合物的峰形对称且不受干扰。表4列出了不同浓度下的加标回收率与平行样品的RSD%，回收率范围为81%-117%， RSD 小于14%，表明该方法具有良好的准确度和精密度。 图7.蚝豉样品中加标浓度为1.0 ug/kg 的各种化合物的 MRM 谱图 结论 本应用采用 Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品进行样品前处理，结合配备多模式进样口和7693A 自动液体进样器的 Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统，提供了一种测定食品中的低浓度N-亚硝胺类化合物的方法。该方法样品前处理过程简单、快速，且具有优异的线性范围、灵敏度、准确度和精密度，适用于对食品中的N-亚硝胺类化合物进行定量分析。 ( 1. GB 2762-2017 食品安全国家标准食品中污染物限量 ) ( 2. GB 5009.26-2016食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定 ) ( 3. Bill Wilson 和 Chin-Ka i Meng， 采用安捷伦的多模式进样口 (MMI)容易实现更低的检测限，安捷伦科技公司应用简报，出版号59 9 0-4169 CHCN， 2 009 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) . 本文介绍了使用 Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统 (GC-MS/MS) 分析食品中N- 亚硝胺类化合物的方法。该方法采用 Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品进行前处理，使用多模式进样口 (MMI) 溶剂放空模式直接进样 5 μL，目标化合物在 0.1–10 μg/L 的范围内具有良好的线性。在实际海鲜干制品的分析中，回收率在81%–117% 的范围内。该方法样品前处理简单、耗时短且灵敏度和回收率高，适用于分析食品中的 N- 亚硝胺类化合物。