单细胞中金属元素检测方案(ICP-MS)

需考虑的主要参数 引言 精确测定单个细胞内的金属含量有助于了解单个细胞对金属或含金属纳米颗粒的摄入与排出机制、含金属的药物与细胞的相互作用机制以及营养物质在细胞群中的分布情况。传统的细胞金属含量测量方法使用平均质量浓度，它假设金属在细胞间均匀分布，从而忽略了单细胞层面金属含量分布及其差异性的关键信息。本白皮书介绍能够快速测量单个细胞内金属含量的技术，单细胞电感耦合等离子体质谱技术 (SC-ICP-MS)。 SC-ICP-MS 技术使用的硬件配置包括： NexION 系列 ICP-MS 仪器与能够将单个完整细胞导入 ICP-MS等离子体的专用进样系统(AsperonTM)数据采集和处理通过 Syngistix TM单细胞应用软件模块完成，配合 NexION ICP-MS 的快速数据采集能力，能定量单个细胞中低至阿克级别的金属含量，测定金属质量分布和含金属的细胞数量。综合考虑这些信息将能够评估与量化细胞群的异质程度。 单细胞 ICP-MS 的工作原理 SC-ICP-MS 的主要挑战之一是如何将细胞导入等离子体。细胞尺寸一般在1-100 pm 之间，它们会被传统的气旋型雾室过滤掉，因为这类雾室仅允许直径小于3-5 pm1.2的气溶胶进入等离子体，而等离子体内大多数气溶胶小于1pm。为克服这一挑战，珀金埃尔默公司的科学家开发了新型 AsperonTM进样系统。该系统通过改进雾室设计，在雾室内增加新的气流，从而允许直径更大的微米级粒子进入等离子体。具体而言，在雾室特意增设一个双通道鞘流气入口，向雾室内部以雾室壁切线方向吹入气体，从而防止细胞碰撞和粘附在雾室壁上。此外，内管装配了微通道，用来分散鞘流气，从而防止液体在气路流道内沉积，最终雾室内形成层流能确保细胞传输效率达到最大水平。 单细胞 ICP-MS 的测量对象 单细胞应用模块可以测量： 单个细胞内的金属含量 细胞群落内的金属含量分布 含金属或纳米颗粒的细胞数量 单个细胞内的纳米颗粒数量 SC-ICP-MS 需考虑或优化的主要参数有六个。图1展示了技术示意图，这六个重要参数在图中高亮显示。 1.样品制备 单细胞的形态和大小各异。有的细胞较为脆弱或较容易受渗透压变化的影响，而有的细胞较为强壮，在渗透压变化达到一定程度时才会发生细胞膜破裂与细胞裂解。因此，了解如何制备待分析的细胞系十分重要。样品制备有以下要求： 形成单细胞溶液(去除聚集的细胞) 将细胞从原介质中取出并洗涤，注意避免细胞聚集或细胞膜破裂 在不含高浓度待测金属的介质中重新悬浮细胞(这对测量细胞内固有金属含量尤其重要) 分析细胞前，通过辅助计数方法计算现有细胞数量 在执行洗涤步骤时应小心操作，因为细胞易被破坏。图2展示了重悬细胞的一般步骤。为避免破坏细胞膜，分离细胞的离心力必须较小，但这可能会导致细胞因多次洗涤后数量减少三次洗涤循环后，细胞数量一般会损失 30%-50%。 2.自动进样 SC-ICP-MS 使用的自动进样功能需要解决以下细胞取样问题： 细胞一般不停留在悬浮液中，会随时间快速沉降 - 某些细胞可能需要恒定的温度才能存活或减少细胞破裂的机会 - 样品体积或细胞数可能有限 进样系统要求较低的样品流速 为解决以上问题，珀金埃尔默的单细胞自动进样器在进样前可以通过模仿吸管搅拌实现细胞重新悬浮。温度可控的样品架可以优化温度，提高分析前细胞的存活率。重悬后的细胞先被输送至样品环，然后经由注射器以2-100 uL min-1的流速提升至 ICP-MS 雾化器。 3. 雾化 细胞被吸入雾室时受到的压力很可能会引起细胞破碎，进而造成结果异常。被吸入雾室过程中细胞的完整性取决于样品流速、雾化气体流速以及细胞尺寸。一般来说， SC-ICP-MS 的样品流速是15-20 uLmin-1， 雾化气流速 一般为0.3-0.4 mL min-1，样品流速与雾化气流速越大，细胞所受到的压力越大。 图3展示了三种藻细胞：蓝隐藻、卵形隐藻、膝口藻，这三种细胞的尺寸分别为 5-7 um、20-30 um 禾50-70 um，下方为完整细胞数随雾化气流速的关系图(图2)。从图中可以看出，在所示流速下，两种尺寸较小的藻细胞在雾化气流速高达0.5 mL min-1和样品流速高达 0.015 mL min1时仍能保持完整，而直径最大的一种藻细胞在雾化气流速低至0.3 mL min时就无法存活，这意味着有必要在分析前检测细胞活性。 4. 将细胞传输至等离子体 传统雾室(例如有挡板的旋流雾室或双通道雾室，如图3所示)设计用于防止大部分大液滴(约4um及以上)进入等离子体，确保大液滴的传输效率远低于小液滴。1.2在这种情况下，由于细胞尺寸以及细胞撞击雾室壁后裂解的原因，会使得细胞进入等离子体的传输效率受限。新型专利雾室(珀金埃尔默开发的AsperonTM进样系统，如图4所示)通过改进雾室设计，在雾室内增加新气流克服了这一局限，提高了细胞导入等离子体的传输效率，。 图3： 不同尺寸细胞在雾化过程中的活性与雾化气流速关系图 5.检测 检测器具有快速数据采集功能，驻留时间可短至10 us，稳定时间为零，因此能够精确测定单个细胞内的金属总量。 6. 数据分析模块 最后，采用专用数据分析软件，能够实时显示数据采集过程中单个细胞事件以及细胞群的峰面积分布(图5)。然后，将峰面积换算为单个细胞内的金属含量(阿克/细胞)，并将结果显示在横纵坐标分别为单个细胞内金属含量与含量频率的直方图中。 图5：利用 Syngistix 单细胞应用软件模块将单细胞内的金属含量转化为单细胞金属含量分布直方图。 总结 珀金埃尔默的单细胞应用模块由专用进样系统和软件模块组成。两者能共同实现以下功能： 将完整的单个细胞导入等离子体 提高更大的微米级粒子导入等离子体的传输效率 单个细胞内的金属含量(阿克级/细胞) 每个细胞群内的金属含量分布 含金属或纳米颗粒的细胞浓度 ( 参考文献 ) ( 1. Schaldach， G . ； Berger， L.； Razilov，I.； Berndt， H.， Characterizationof a cyclone spray chamber for ICP spectrometry by computersimulation. Journal of Analytical Atomic Spectrometry 20 0 2， 17， (4)， 334-344. ) 2. Matusiewicz， H.；Slachcinski， M.； Almagro， B.； Canals， A.，Evaluation of Various Types of Micronebulizers and SprayChamber Configurations for Microsamples Analysis by MicrowaveInduced Plasma Optical Emission Spectrometry. ChemiaAnalityczna 2009， 54， (6)，1219-1244. 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 欲获悉全球办事处的完整清单， 请登录www.perkinelmer.com/ContactUs 版权@2017，珀金埃尔默公司。版权所有。 Perkinelmer是珀金埃尔默公司的注册商标。所有其他商标属于相应所有者的财产。 本文介绍了能够快速测量单个细胞内金属含量的技术，单细胞电感耦合等离子体质谱技术 (SC-ICP-MS)，能定量单个细胞中低至阿克级别的金属含量，测定金属质量分布和含金属的细胞数量。综合考虑这些信息将能够评估与量化细胞群的异质程度。