生物制剂中生物制剂蛋白检测方案(液相色谱仪)

| 技术简报WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 技术简报 通过肽分析专用反相分析法评估HPLC、UHPLC和UPLC系统的性能 目的 利用现有的肽分析专用反相分析法，以分离度和峰容量作为衡量因素，评估不同系统平台(HPLC、UHPLC和UPLC)的相对性能。 背景 虽然在后期研发和质控环境下所采用的药物分析方法大多都基于HPLC系统，但现代化分析方法和仪器具有明显优势。因为生物制剂本身就比小分子复杂，所以分析时需要更大限度地了解大分子的复杂性和变异性。为提升整体产品质量，行业及监管机构现已开始逐渐认可并支持不断改进工艺并启用新仪器。将HPLC系统升级为系统扩散体积更低的LC平台后， 传统方法得以重现或更新，从而能够利用更好的系统性能和现代色谱柱技术。 系统扩散体积低的现代LC系统具有更加卓越的的生物分子分离性能。 图1.不同LC平台的柱外谱带展宽。峰宽(4o)由Empower处理确定，并用于计算柱外谱带展宽(uL)，结果见表1。 在本研究中，我们通过反相梯度方法对不同系统扩散性体积的三种四元LC平台进行了评估。虽然等度方法在低扩散系统中的性能提升更加明显，但在生物制剂分析中，梯度方法更为常用。因此，将肽标准品用作模型分析物进行分析，用以评估不同系统统散体积的性能差异。利用Empower3色谱数据软件积分色谱图，并依据USP指南(可在处理方法中指定)报告峰宽和分离度。 解决方案 通过测定峰宽(单位min)，再乘以流速(0.3 mL/min)， 即可算出柱外谱带展宽，结果见表 1。将高扩散系统转换为低扩散系统后可观察到性能大幅提升(扩散性： Alliance>Arc Bio系统 >H-Class Bio系统)。 为研究低扩散系统影响分析方法性能的方式，本研究利用肽分析专用反相梯度方法评估了不同系统的分离度和峰容量。选择肽标准品作模型分析物进行概念论证。三种系统均采用10 min梯度(5%-50%的乙腈TFA溶液)和Waters""XBridgeBEH"C色谱柱(130A， 2.5 pm，4.6x100 mm)，方法条件始终保持一致。色谱分析结果如图2所示。 ACQUITY Arc Bio系统和H-Class Bio系统能够生成更窄的色谱峰，因此可以获得更大的峰容量和更出色的分离度。三种系统各自的峰容量和分离度如表2所示。色谱峰5和6之间的分离度由1.7 (HPLC)提高到了2.7 (UHPLC)和3.1(UPLC)。同样，峰容量也从118(HPLC)提高到了170(UHPLC)和196 (UPLC)。 图2.使用已有方法在LC平台上转换评估系统性能。对保留时间进行补偿以消除驻留体积差异。(混标组分按洗脱顺序排列如下：1.血管紧张素(片段1-7)、2.缓激肽、3.血管紧张素ll、4.血管紧张素l、5.肾素底物、6.-、7.烯醇酶T35、8.烯醇酶37。) LC 类别 系统 配置 4o处的 柱外谱带展宽(uL) HPLC Alliance 30 cm CH. 紫外可见光检测器 50 UHPLC Arc Bio (P1， P2) CH-A， 紫外可见光检测器 23 UPLC H-Class Bio CH-A，TUV 检测器 7 表1.不同LC平台的柱外谱带展宽。 系统 分离度 (峰5和峰6) 峰容量， 4o(平均值) Alliance 1.7 118 Arc Bio 2.7 170 H-Class Bio 3.1 196 表2.不同LC平台的分离度和峰容量比较。峰容量按照以下公式计算： PcaP。=1+[(2.35/4)(*梯度Wh，平均)]。 由于各系统所采用的色谱柱和条件均相同，因此所有峰展宽在很大程度上要归因于各系统间的组件差异，即构成进样器到检测器流路的组件。可以预见，对于蛋白质酶解物等更加复杂的样品，低扩散系统也能够以更高的灵敏度实现关键分析物对的分离。为进一步展示低扩散系统的优势，还可以更新传统方法以便能够利用粒径较小的窄内径色谱柱，而传统仪器则超过了上述色谱柱的压力限制。 ( 结论 ) 以HPLC、UHPLC和UPLC系统为对象，通过评估分离度和容量比较了低扩散LC系统的性能改进。计算了各系统的柱外谱带展宽， UHPLC(Arc Bio系统)和UPLC(H-Class Bio系统)平台的计算结果与预期相同，远小于HPLC系统(Alliance)。利用肽分析专用反相梯度方法举证说明低扩散系统的作用，证明了三种不同LC平台间分离度和峰容量的提升。无论是复杂分析物的常规分析还是方法开发，都需要注意仪器平台之间的性能差异，这样才能够为生物分子的分析提供适合的解决方案。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、The Science of What’s Possible、ACQUITY、UPLC、Empower、BEH、Alliance和Arc是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 成都：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 820 2676 Www.waters.com @沃特世公司。中国印刷。H TC-PDF LC系统的性能改进。计算了各系统的柱外谱带展宽，UHPLC(Arc Bio系统)和UPLC(H-Class Bio系统)平台的计算结果与预期相同，远小于HPLC系统(Alliance)。利用肽分析专用反相梯度方法举证说明低扩散系统的作用，证明了三种不同LC平台间分离度和峰容量的提升。无论是复杂分析物的常规分析还是方法开发，都需要注意仪器平台之间的性能差异，这样才能够为生物分子的分析提供适合的解决方案。