富马酸喹硫平标准中按照USP各论的要求制备指定浓度的样品溶液检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 使用多种液相色谱系统运行USP富马酸喹硫平杂质分析方法 Amanda B. Dlugasch、Jennifer Simeone和Patricia R. McConville 应用优势 Alliance"HPLC、ACQUITY""Arc""UHPLC和ACQUITY UPLC" H-Class PLUS系统均可成功运行USP富马酸喹硫平杂质分析方法。 梯度洗脱方法可在多种液相色谱系统上运行。 Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统分样品杂质的结果展现出良好的重现性。 沃特世解决方案 Alliance HPLC系统 ACQUITY Arc系统充 ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统 XBridge色谱柱 Empower"3色谱数据软件 关键词 ACQUITY UPLC H-Class PLUS，ACQUITY Arc UHPLC， Alliance HPLC，USP方法，富马酸喹硫平，杂质，梯度洗脱 许多制药公司都采用美国药典(USP)方法分析活性药物成分(API)中的杂质。通常这些方法都使用梯度洗脱来分离杂质化合物。当USP方法采用梯度洗脱时，考虑使用哪种类型的液相色谱系统进行分析非常重要。如果方法条件采用较大尺寸的色谱柱或运行时间较长，我们似乎就必须在高效液相色谱(HPLC)系统上运行该方法，而实际上这类方法可以在多种系统上有效运行。只要所用系统满足USP方法的系统适应性要求，我们就可以采用扩散比HPLC系统更低、可耐受压力范围比HPLC更宽的液相色谱系统(例如， UHPLC和UPLC系统)进行分析。 在本应用纪要中，我们将在Alliance HPLC、ACQUITY Arc UHPLC和ACQUITY UPLC H-Class PLUS这三种不同类型的液相色谱系统上运行富马酸喹硫平杂质(图1)的USP分析方法，并根据USP各论中所列的系统适应性要求评估这些系统能否成功运行该USP分析方法。 图1.富马酸喹硫平(API)及其杂质(喹硫平相关杂质化合物B、喹硫平相关杂质化合物G和脱乙氧基喹硫平)。 实验 样品描述 富马酸喹硫平标准品(目录号：1592704)、喹奎平系统适应性标准品(目录号：1592715)、喹硫平相关化合物B(目录号：1592737)和喹硫平相关化合物G(目录号：1592781)均购自美国药典。未知富马酸喹硫平样品购自Alibaba.com。 按照USP各论的要求制备指定浓度的样品溶液。使用溶液A：溶液B(86：14)的稀释剂配制系统适应性溶液、标准品溶液和峰鉴定溶液，其中溶液A为乙腈，溶液B为乙腈和缓冲液的混合溶液(25：75)。以溶液A为溶剂配制样品溶液。 系统适应性溶液、标准品溶液和样品溶液的浓度分别为1.0 mg/mL、0.001 mg/mL和1.0 mg/mL。USP富马酸喹硫平标准品、USP喹硫平相关化合物B和USP喹硫平相关化合物G的峰鉴定溶液浓度分别为1 pg/mL、10 pg/mL和2 ug/mL。 LC条件 LC系统： Alliance e2695分离单元，配备100pL 流动相A： 乙腈与缓冲液的混合溶液(25：75) 时间 流动相A 流动相B (min) (%) (%) 0.0 100.0 0.0 25.0 100.0 0.0 60.0 29.3 70.7 60.1 100.0 0.0 68.0 100.0 0.0 采用USP各论中的条件， 在Alliance HPLC、ACQUITY Arc UHPLC和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统上分析富马酸喹硫平杂质。 按照USP各论中的说明配制峰鉴定溶液、系统适应性溶液、标准品溶液和未知样品溶液，并进行六次重复进样分析。根据各论中针对杂质分析规定的系统适应性要求和可接受标准评估各个系统。 峰鉴定溶液中的三种组分(喹硫平、喹硫平相关化合物B和喹硫平相关化合物G)得到了准确鉴定，鉴定依据是各论中给出的信息(包括相对保留时间和峰尺寸)。 采用扩散较低的系统运行杂质分析方法，可缩小峰宽并增加峰高2，这有助于降低系统对低丰度杂杂峰的检测限。经测定， Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITYUPLC H-Class PLUS系统的系统扩散体积分别为44.5pL、21.5pL和9.6pL。观察峰鉴定溶液的色谱图可以看到峰高增加、峰宽减小的趋势(图2)。随着LC系统的扩散降低(从Alliance HPLC系统到ACQUTIY UPLC H-Class PLUS系统)，所有三种杂质化合物的峰高均有所增加，且峰宽减小(图2)。 两个邻近洗脱峰之间的分离度可反映系统运行分析方法的效率3。对于USP杂质方法，我们使用系统适应性溶液来评估两对关键分析物对之间的分离度。根据USP各论的要求，脱乙氧基喹硫平峰与喹硫平峰之间的分离度不得低于(NLT)4.0，且喹硫平相关化合物B峰与喹硫平相关化合物G峰之间的分离度不得低于3.0(图3)。如表2所示，这三种液相系统的系统适应性溶液中分离度结果均符合USP要求。 图2.使用不同LC系统分析峰鉴定溶液中的杂质化合物得到的色谱图，图中显示了相应的峰宽和峰高。依据USP各论中给出的相对保留时间鉴定化合物。化合物鉴定结果如下：1：喹硫平相关化合物G；2：喹硫平相关化合物B；3：喹硫平。 图3.采用三种LC系统分析系统适应性溶液得到的结果。依据USP各论中给出的相对保留时间鉴定化合物。化合物鉴定结果如下：1：喹硫平相关化合物G；2：喹硫平相关化合物B；3：脱乙氧基喹硫平；4：喹硫平。 表2.三种LC系统分析系统适应性溶液的分离度结果汇总。 脱乙氧基喹硫平 相关化合物B 与相关化合物G 之间的分离度 与喹硫平之间的分离度 Alliance HPLC 系统 6.6 11.0 ACQUITY Arc UHPLC 7.4 13.3 系统 ACQUITYUPLC 6.9 13.4 H-Class PLUS 系统 USP 要求 NLT 4.0 NLT 3.0 根据六次重复进样的相对标准偏差百分比(%RSD)和拖尾因子来评估系统重现性和峰对称性。USP各论规定，标准品溶液中喹硫平峰的拖尾因子不得大于(NMT)2.0，且喹硫平的峰面积%RSD和保留时间%RSD不得大于5.0%(图4)。各系统的标准品溶液分析结果如表3所示，所有结果都满足拖尾因子和%RSD标准。 分析未知样品时，需要进样已知浓度的标准品溶液(图4)。使用以下公式计算未知样品中所含杂质的百分比： 其中r是样品溶液中每种杂质的峰响应，r是标准品溶液中喹硫平的峰响应，C 是标准品溶液中USP富马酸喹硫平标准品的浓度(mg/mL)，C是样品中富马酸喹硫平的浓度(mg/mL)， F是各论中给出的相对响应因子'。分析未知样品得到了两个杂质峰，其中一个经鉴定为脱乙氧基喹硫平，另一个峰无法确定。 使用各论中给出的响应因子(如果适用)计算杂质含量百分比。计算得到的脱乙氧基喹硫平杂质和未知杂质含量均低于各论中的可接受标准值。此外，，：三种色谱系统得到的脱乙氧基喹硫平杂质和未知杂质计算浓度都非常一致且重现性良好(表4)。 保留时间 峰面积 拖尾因子 %RSD %RSD Alliance HPLC系统 1.0 0.14 0.84 ACQUITY Arc UHPLC系统 1.0 0.05 1.14 ACQUITYUPLC H-Class 1.0 0.10 1.18 PLUS 系统 USP要求 NMT2.0 NMT5.0% NMT 5.0% 图4.在Alliance HPLC系统上分离含有喹硫平的标准品溶液(0.001mg/mL)(上图)以及未知样品溶液(1.0 mg/mL)(下图)得到的色谱图。依据USP各论中给出的相对保留时间鉴定化合物。化合物鉴定结结如下：1：脱乙氧基喹硫平；2：喹硫平；3：未知杂质。 表4.使用三种LC系统分离未知样品中的杂质得到的脱乙氧基喹硫平杂质和未知杂质含量计算值(百分比)。 脱乙氧基喹硫平 未知杂质 Alliance HPLC系统 0.10% 0.07% ACQUITY Arc UHPLC系统 0.13% 0.08% ACQUITY UPLC H-Class 0.12% 0.08% PLUS系统 USP可接受标准 NMT 0.15% NMT 0.10% ( 结论 ) 许多USP梯度洗脱方法都使用填料粒径>3um的色谱柱，这些方法可在多种LC系统上有效地运行。本研究在三种不同的LC系统上(Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统)成功运行了USP富马酸喹硫平杂质分析方法。这三种液相色谱系统上的结果均符合USP系统适应性要求，并且在分析未知样品中的杂质浓度时得到了非常一致且重现性良好的结果。 ( 参考文献 ) ( 1. Official Monographs， Q uetiapine Fumarate， USP 40 NF35 S1， United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 40-NF35 S1) Baltimore， M D： United Book Press，Inc.； 2017. p.5939. ) ( 3. S S nyder， Lloyd R.； Kirkland， Joseph； Dolan，John W. Introduction to Liquid Chromatography，3rd Edition. H o boken： Wiley and Sons， 2010. Section 2. 5 p54-57. Print. ) ( 4.( Chapter < 621> Chromatography. United States Pharmacopeia and National Formulary (USP40-NF35 S1) Baltimore， MD： United Book Press，Inc.； 2017. ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 ( 沃特世科技(上海)有限公司 ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 Waters、 The Science of What's Possible、ACQUITY、UPLC、Alliance、Arc、Empower和XBridge是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 @2018年沃特世公司。中国印刷。2018年6月720006292ZH AG-PDF ( 免费售后服 务 热线：800(400) 820 2676 www.waters.com ) 使用多种液相色谱系统运行USP富马酸喹硫平杂质分析方法 许多制药公司都采用美国药典(USP)方法分析活性药物成分(API)中的杂质。通常这些方法都使用梯度洗脱来分离杂质化合物。当USP方法采用梯度洗脱时，考虑使用哪种类型的液相色谱系统进行分析非常重要。如果方法条件采用较大尺寸的色谱柱或运行时间较长，我们似乎就必须在高效液相色谱(HPLC)系统上运行该方法，而实际上这类方法可以在多种系统上有效运行。只要所用系统满足USP方法的系统适应性要求，我们就可以采用扩散比HPLC系统更低、可耐受压力范围比HPLC更宽的液相色谱系统(例如，UHPLC和UPLC系统)进行分析。在本应用纪要中，我们将在Alliance HPLC、ACQUITY Arc UHPLC和ACQUITY UPLC H-Class PLUS这三种不同类型的液相色谱系统上运行富马酸喹硫平杂质(图1)的USP分析方法1，并根据USP各论中所列的系统适应性要求评估这些系统能否成功运行该USP分析方法。