单细胞蛋白组中水平的鉴定性能检测方案(液质联用仪)

thermoscientific 热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。C 2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 Orbitrap Exploris 480 提升单细胞蛋白组水平的鉴定性能 黄敏，周岳赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词： Orbitrap Exploris 480，单细胞蛋白组，低流速， MSpep search 前言 实验条件 规蛋白组学一般为基于细胞群体内的研究，因此不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。 实验材料 Hela 酶角肽段标准品(PierceTM HeLa Protein Digest Stan-dard， 88323)用0.1%甲酸，2%乙腈溶液溶解，并稀释至10ng/pL， 5ng/pL， 2ng/pL， 1ng/pL和200pg/pL。 纳升液相色谱质谱联用 (nano LC-MS) 另外，一些样品量受限的样品，例如具有高活力和转移潜能的CTC细胞(循环肿瘤细胞)，它们浓度极低且罕见，而这正是单细胞分析所擅长的领域。还有一些其它重要但样品量有限的样品，同样可从中受益，包括外泌体，细针穿刺和活检组织切片样品等。 高效液相色谱仪： Thermo Ultimate3000 RSLCnano；色谱柱：单柱模式采用AcclaimTM PepMapTM 100 C18， 50um*15cm， 2um (164943)；双柱模式联合使用上述分析柱与捕集柱AcclaimTM PepMapTM 100 C18， 75um*2cm，3um(164946)；流动相：A：0.1%甲酸水；B：0.1%甲酸，80%乙腈；梯度流速见表1。 鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测极具挑战性。 表1液相梯度 Orbitrap Exploris 480是赛默飞世尔科技在2019年ASMS推出的QOrbitrap质谱仪，可实现深度的蛋白组分析，新增多种定量模式，并通过硬件设计的改进提高仪器耐用性和稳定性。本文，我们考察了Orbitrap Exploris 480对不同上样量(从200pg到10ng)的Hela酶解肽段的鉴定性能。方法优化后，60min梯度时，采用更低的100nL/min流速，并结合使用谱图库检索MSpep search方法， 200pg Hela肽段(相当于单个人类体细胞细胞蛋白量)可鉴定近600个蛋白，1721条肽段。 时间(min) 流速(nL/min) %B 0 100 3 2 100 5 52 100 18 54 100 99 60 100 99 61 200 3 70 200 3 质谱仪： Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480质谱仪；喷雾电压：2.2 kV；毛细管温度：320C；一级Orbitrap分辨率120K， Normalized AGC Target 300%，最大离子注入时间25ms；动态排除时间60s；二级HCD碎裂，碎裂能量NCE30，分辨率30K或60K， Normalized AGC Target 100%，最大离子注入时间分别为118ms (200pg、1ng和2ng上样量)，54ms (5ng和10ng上样量)， Top15采集。 数据分析 数据分析使用Proteome Discoverer 2.4版本，分别使用Sequest和MSpep search方法进行蛋白组鉴定， FDR设置为1%，其中MSpep search中使用NIST_Human_Orbitrap_HCD， NIST_Pro-teome_Human_synthetic_HCD和ProteomeTools_HCD28_PD谱图库。 实验结果 1.MS2最大离子注入时间优化 增加二级的最大离子注入时间可以提高谱图的质量，有利于低上样量时的肽段鉴定，但同时会减少谱图数目，反而会减少肽段和蛋白鉴定数目，因此，需要针对不同的上样量进行优化。图1以200pg上样量为例，此时流速为150nL/min。由图可知200pg上样量时的最佳二级离子注入时间为118ms，分辨率60K。同样可得，1ng、2ng、5ng和10ng上样量时的最佳二级离子注入时间分别为118ms、118ms、54ms和54ms，分辨率30K。 图1200pg 肽段上样量时，不同MS2最大离子注入时间下的肽段和蛋白鉴定结果(数据分析采用数据库检索Sequest) 2.液相流速优化 文献指出，更小内径的色谱柱，更低的液相流速有利于提高质谱信号强度，从而提高肽段和蛋白的鉴定数目。常规蛋白组学一般使用75pm或100pm内径的色谱柱，本文考察了较小内径的50pm内径色谱柱在不同流速(50~150nL/min)下的鉴定性能(图2)。 图2不同流速时，不同上样量的肽段和蛋白鉴定结果(数据分析采用数据库检索Sequest) 结果可知，流速为100nL/min时，除了5ng上样量之外，其它上样量时所得肽段鉴定数目均最多；蛋白数目在5ng和10ng上样量时与60nL/min相近，其它上样量时均最高，因此以此流速进行后续实验。 3.不同肽段上样量的分析结果 完成参数优化后，接着我们对不同肽段上样量进行分析，每个上样量重复三次，代表性色谱图如图3所示 图3不同肽段上样量的代表性色谱图 数据分析分别采用数据库检索Sequest和谱图库检索MSPepsearch方法，结果如图4所示。60min梯度，结合FAIMS后，200pg Hela肽段(相当于单个细胞)， Sequest 方法鉴定396个蛋白，973条肽段；而采用MSpep search 方法可提升至598个蛋白，1721条肽段，比数据库检索方法提升了51%和77%。 图4不同肽段上样量的蛋白和肽段鉴定结果(对比Sequest和MSPep search方法) 4.单柱模式与双柱模式的对比 由于本文中使用的是标准品，因此单柱模式不会影响对色谱柱或者系统状态。但在实际的单细胞水平的样品中，一般会采用一锅法的反应，即在同一装置中完成裂解、酶解等操作。且为 了避免样品的损失，往往不再进行脱盐处理，不可避免会引入污染物，影响色谱柱使用和污染系统，所以双柱模式可能更适合实际样品的分析。另外，双柱模式中使用捕集柱可缩短上样时间，从而缩短整体分析时间，提高分析通量。所以本文对这两种模式进行了简单对比，结果如图5所示。 图5单柱与双柱模式的分析结果对比(数据分析采用数据库检索Sequest) 由上图可知，双柱模式会造成一定的肽段和蛋白鉴定减少，不同上样量时，蛋白和肽段鉴定数目双柱模式比单柱模式减少20-30%左右。但由于使用的捕集柱内径较大(75pm)，因此后续可使用更小内径的捕集柱，或适当延长一定的梯度时间再行分析比对。此外，还需通过实际样品考察两种模式对系统污染的影响，评估仪器的实际在线时间。 Orbitrap Exploris 480具有深度蛋白组覆盖，多种定量模式及高可靠性稳定性的优势。除了适用于常规蛋白组学以外，本文将其应用在单细胞蛋白组水平的分析。使用低内径色谱柱，低液相流速，以及质谱条件优化后，60min梯度， 200pg Hela肽段(相当于单个细胞)，结合谱图库检索MSpep search方法可鉴定约600个蛋白，1721条肽段，比数据库检索方法提升了51%和77%。该方法可用于单细胞水平以及其它少量样品的蛋白组学分析。 ( 1. Ying Zhu， Rui Zhao， Paul D. Piehowski， R o nald J. Moore， Su- j ung Lim， Victoria J. Orphan， Ljiljana Pasa-Tolic， W ei-Jun Qian，Richard D. Smith， Ryan T. K elly. Subnanogram proteomics：Impact of L C column selection， MS instrumentation and da t aanalysis strategy on proteome coverage for t race samples， In-ternational Journal of Mass Spectrometry， 2018， 427： 4 -10. ) Orbitrap Exploris 480具有深度蛋白组覆盖，多种定量模式及高可靠性稳定性的优势。除了适用于常规蛋白组学以外，本文将其应用在单细胞蛋白组水平的分析。使用低内径色谱柱，低液相流速，以及质谱条件优化后，60min梯度，200pg Hela肽段（相当于单个细胞），结合谱图库检索MSpep search方法可鉴定约600个蛋白，1721条肽段，比数据库检索方法提升了51%和77%。该方法可用于单细胞水平以及其它少量样品的蛋白组学分析。