中药中柴胡，代谢物检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 23.1-25min (5%B)。 基于Orbitrap ID-X Tribrid MS技术的中药柴胡体外肠内菌代谢物分析 刘国强，范自全，徐牛生，赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 传统中药以口服用药为主，其化学成分受胃肠道酸碱性、肠道微生物及代谢酶等影响常发生转化，使其生物利用度降低，体内除中药原形成分外，还可能有大量代谢产物的存在，这些体内吸收化学成分是阐明中药发挥药效机制的直接物质基础。要想揭示中药体内药效物质，代谢产物研究是不可缺少的重要组成部分，尤其是苷类及其他结构易转化的化学成分(如萜类等)，其生物利用度较低，在体内主要以代谢产物的形式存在，在此种情况下，代谢产物可能是药效的唯一或主要来源叫。然而，由于中药成分的代谢规律不明确、代谢产物含量低难以鉴定等原因，大大制约了中药体内药效物质基础的研究。 为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统LC Q-TOFMS高分辨质谱的DDA数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级质谱图用于结构鉴定。新一代Orbitrap ID-X Tribrid三合一质谱仪由于具有Acquire X智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及包含列表，，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分析。 柴胡Bupleuri Radix为伞形科植物柴胡(又称北柴胡) Bulpeurumchinese DC. 和狭叶柴胡(又称南柴胡)Bulpeurum scorzonerifo-lium Willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功效。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用I3-5]。近年来，液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢 研究16.7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。 本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有AcquireX采集功能的Orbitrap ID-X Tribrid MS技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用Compound Discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数据进行解析，最终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临床合理应用奠定理论基础。 实验方法 1.样品前处理 取柴胡粉末约20g， 加入150mL 70%乙醇置于圆底烧瓶中，加热回流提取60min， 离心后取上清液，抽滤后滤液旋转蒸发浓缩至20mL，冻干保存。彤内菌液的收集与制备参考文献[8]，培养时间分别为0小时(对照组)，1小时和24小时作为实验组样品。用等量的磷酸钾缓冲溶液代替底物溶液，其它操作同实验组，此作为空白组。 2.色谱方法 ( 超高效液相UHPLC(Dionex Ultim a te 3000， The r mo Fis h er Scien-tific )系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱 温箱，和 二 元泵组成。色谱柱为Hypersil Gold C18 (2.1 mm x100mm， 1 .9um， Thermo Fishe r Scientif i c)；流动相为0.1%甲酸水 (A)和乙腈100%(B)。流速为0.3mL / /n min， 进样体积3uL，柱温40℃；采用梯度洗脱：起始，5%(B)； 0-1min (5%-5%B)； 1-5min (5%-50%B)； 5-19min (50%-98%B)； 19-23min (98%-98%B)； ) 3.质谱条件 仪器： Thermo Scientific Orbitrap ID-X Tribrid 三合一质谱仪，利用AcquireX 智能数据采集模式获得HRMS/MS， ±ESI检测模式，离子源参数如下： Spray Voltage ±3.5KV； Sheath Gas Pressure： 40arb；Aux Gas Pressure：10arb； Capillary Temperature： 275℃； Heater Tem-perature： 350℃。质谱扫描参数：扫描范围 (Scan range)(m/z)：120-1500； Full Mass分辨率(Orbitrap resolution)：120000， MS/MS分辨率：30000；使用Xcalibur 4.1和 Compound Discoverer 3.0化学工作站进行数据处理 1. Acquire X智能化数据采集模式 中药代谢物由于其成分的高度复杂性，而且代谢物检测容易受到基质的干扰，传统的DDA模式很难采集到低含量代谢物的二级质谱图进行定性分析， Orbitrap ID-X中的Acquire X智能化数据采集模式可以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分析。AcquireX采集数据过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生成排除列表，排除背景离子；柴胡体外肠内菌孵育样品用于生成包含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时更新采集方法。如某一离子已经触发了MS/MS碎片，在下一针采集将自动加入到排除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于MS/MS离子的触发(如图1所示)。 图1. AcquireX智能化数据采集工作流程 2.数据处理流程 数据处理采用Compound Discoverer (简称CD)的工作流程Metabo-lism Expected w FISh and Unknown w MDF Pattern and CompoundClass Scoring进行代谢物的鉴定。实现自动峰提取、空白扣除、分子式生成，代谢物查找及鉴定等步骤。软件中嵌入了常见的Ⅰ相代谢和Ⅲ相代谢反应，可以用于已经代谢物的快速查找和鉴定工作。此外上述工作流程还集合了MDF， FISh Trace， 和Pattern Trace 多种算法，s，可以用于未知代谢物的查找和鉴定(如图2)。在对代谢物完成峰提取后，CD可以将代谢物的二级质谱图与母药的二级质谱图进行镜像比对，帮助进行代谢位点确定。 图2.Compound Discoverer 代谢物成分鉴定工作流程 3. Fragment Ion Search (FISh) 自动辅助进行代谢位点确认 选择柴胡中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷A和绿原酸为母药，看这些物质在孵育基质样品中的代谢情况。下图3a所示为柴胡皂苷A的代谢物Dehydration+Dehydration+Stearyl Conjugation的二级质谱图，绿色颜色标记的碎片为代谢物和母药相同的碎片，蓝色颜色标记的碎片为代谢物的变化位点，由特征性碎片m/z 357.27844可知此未知代谢物位点应在葡糖糖上。下图3b所示为绿原酸的代谢物Dehydration+Dehydration+Acetylation的二级质谱图，由特征性碎片m/z169.01262可知此未知代谢物位点应发生在奎尼酸上。 1-05DOA_5 (HCC1D. 5(F84)#8500FT-18.345 min， MS2， FTM5 101171140 图3.柴胡皂苷A和绿原酸代表性代谢物的二级质谱 本实验采用Orbitrap ID-XTribridMS高分辨液质联用技术，结合Compound Discoverer软件中的代谢物分析工作流程，对中药柴胡体外肠内菌代谢物进行了快速准确的分析。Compound Discoverer内置I相+II相代谢途径，针对已知和未知代谢物开采用质量亏损过滤(MDF)，碎片离子搜索策略(FISh)，特征同位素，共有碎片检索等方式，寻找代谢物；同时软件提供多种统计学工具，通过不同给药时间点或不同处理方式统计学差异，确证代谢物。选择柴胡中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷A和绿原酸为母药，在孵育基质样品中柴胡皂苷A正离子模式共鉴定出14种可能的代谢物，负离子模式鉴定出11种可能的代谢物；绿原酸共鉴定出5种可能的代谢物。 ( [1]邱峰，浅谈中药成分体内代谢研究，国际药学研究杂志，2010， 37，321-327. ) ( [2]中国药典[S].一部.2015. ) ( [3]Y.Motoo and N. Sawabu， U ， “ “Antitumor effects of saikosaponins，baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines， ” CancerLetters， 1994， 86，91-95. ) ( [4] M . S. Idri s -Usman，“Antinociceptive and a n tipyretic propertiesof the pharmaceutical herbal preparation， Radix bupleuri inrats，”Journal of Medicinal Plants Research， 2010，4，659-663. ) ( [5] B. P. Bermejo， M. J. A. Martinez， A. M. S . Sen et a l.， “In vivo and in vitro antiinflammatory a ctivity of saikosaponins，" L Life Sci-ences， 1998，63，1147-1156. ) ( [6] G.QLiu， Y .T， G. Li， L. Xu， R. Song， Z.J Zhang， Metabolism ofSaikosaponin a in Rats： D iverse Oxidations on the AglyconeMoiety in Liver and I ntestine in Addition to Hydrolysis of Glycosi-dic Bonds， Drug Metab Dispos， 2013，41， 622-633. ) ( [7] Pei Yu， Hongcong Qiu， Min Wang， Yu a n Tian， Zunjian Zhang， RuiSong. In v itro metabolism study of saikosaponin d a n d its deri-vatives in rat liver microsomes， Xenobiotica，2017， 47， 11 - 19. ) ( [8]冯桂芳，刘舒，皮子凤，宋凤瑞，刘志强，基于超高效液相色谱-质谱联用技术的人参皂苷体外I相代谢研究，质谱学报， 2017， ) thermoscientific ThermoFisherSCIENTIFIC 热线话ww.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 传统中药以口服用药为主，其化学成分受胃肠道酸碱性、肠道微生 物及代谢酶等影响常发生转化，使其生物利用度降低，体内除中药 原形成分外，还可能有大量代谢产物的存在，这些体内吸收化学 成分是阐明中药发挥药效机制的直接物质基础。要想揭示中药体内 药效物质，代谢产物研究是不可缺少的重要组成部分，尤其是苷类 及其他结构易转化的化学成分（如萜类等），其生物利用度较低， 在体内主要以代谢产物的形式存在，在此种情况下，代谢产物可能 是药效的唯一或主要来源[1]。然而，由于中药成分的代谢规律不明 确、代谢产物含量低难以鉴定等原因，大大制约了中药体内药效物 质基础的研究。为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱 对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代 谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统LC Q-TOF MS高分辨质谱的DDA数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级 质谱图用于结构鉴定。新一代Orbitrap ID-X Tribrid三合一质谱仪由 于具有Acquire X智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及 包含列表，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分 析。柴胡Bupleuri Radix为伞形科植物柴胡（又称北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升举阳气之功效[2]。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油 类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保 肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用[3-5]。近年来，液相色谱-质谱联 用技术（LC-MS）的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢研究[6,7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结 果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有AcquireX采集功能 的Orbitrap ID-X Tribrid MS技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先 用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用 Compound Discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数 据进行解析，最终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临 床合理应用奠定理论基础。