食品中丙烯酰胺检测方案(液相色谱仪)

使用 Captiva EMR-Lipid 与 LC-MS/MS相结合对食品中的丙烯酰胺残留量进行测定 作者 摘要 安娟，吴翠玲，黄悯嘉 本文介绍了一种结合 QuEChERS 和 Captiva EMR-Lipid 进行样品前处理，利用 LC-MS/MS来分析食品中丙烯酰胺的方法。该方法简便易用，重现性良好，且灵敏度高，完全满足国际和国内标准对于食品中丙烯酰胺违禁物检测限的要求。 丙烯酰胺是一种含有不饱和双键的酰胺，经过体内代谢可产生环氧丙酰胺 (Glycidamide)，而环氧丙酰胺对体内的血红蛋白和 DNA 等大分子物质有较强的烷基化作用。因此，国际癌症研究机构 (IARC) 于1994年将丙烯酰胺列为 2A 类“人类可能致癌物质”。经高温加工的淀粉类食品是丙烯酰胺的主要来源。因此，建立高效、简单、快捷的食品中丙烯酰胺分析方法，对于评估丙烯酰胺含量和寻找减少其产生的方法非常重要。 《食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定》 (GB 5009.204-2014)”中规定的方法包括LC-MS/MS 法和 GC-MS 法。其中 LC-MS/MS 法既具有色谱的较高分离能力，又有质谱的高灵敏度和离子检测特异性，但样品前处理所用的基质固相分散萃取方法和固相萃取柱净化法均步骤繁多，不易操作；而 GC-MS 法需要衍生化处理，操作耗时长，不适用于大批量样品分析。而且， GB/T 5009.204-2014 采用水提取丙烯酰胺，对于含有大量脂肪、蛋白和淀粉的食品，会严重影响丙烯酰胺的提取效率。此外，由于经过高温热加工的淀粉类食品含有较多的杂质，丙烯酰胺提取液还需经过进一步净化以去除杂质。 本文介绍了一种将 Captiva EMR-Lipid 与 LC-MS/MS 结合使用来分析食品中丙烯酰胺的方法。该方法采用乙腈提取样品， 经 Captiva EMR-Lipid 过滤净化以去除脂肪和蛋白质干扰物质，然后进行 LC-MS/MS分析。该方法的线性范围为 0.5-10 ng/mL， 定量限为 10 pg/kg。对部分市售薯片和曲奇饼干样品进行检测，结果发现其中的丙烯酰胺含量均在10 pg/kg以上。 试剂和样品 甲酸、乙腈均为色谱纯，购于迪马公司；实验用水为经过密理博纯水仪处理的二次水。 丙烯酰胺和丙烯烯胺内标的标准品，纯度均≥99.0%，购于Dr公司。 标准储备液的制备：丙烯酰胺、丙烯酰胺内标分别用甲醇配制成100 mg/L的单标储备液。分别取适量的单标储备液用甲醇溶液配制成1 mg/L 的混标工作液。 样品为市售食品。 仪器与消耗品 Agilent 1290 Infinity lI液相色谱系统与 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统。 Agilent Bond Elut QuEChERS丙烯酰胺萃取盐包(部件号5982-5850) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 小柱 300 mg， 3 mL(部件号5190-1003)。 样品前处理 称取样品2g， 加入10mL水；加入陶瓷均质子，涡旋混匀后，静置20分钟；加入10 mL 乙腈和 Agilent Bond Elut QuEChERS丙烯酰胺萃取盐包，涡旋振荡5分钟；然后在9000 r/min 的转速下于4C低温离心10分钟；移取4mL 上清液至另一离心管中，再加入1mL水充分混匀，并经过离心后取 3 mL 过 CaptivaEMR-Lipid 300 mg 小柱；取1mL流出液于40℃下用氮气吹至近干，用流动相(0.1%甲酸水)将其定容至1mL。经 Agilent0.2 um Captiva RC 膜过滤后，进行 LC-MS/MS 测定。样品前处理流程图如图1所示。 2g样品，加入标准品(内标)，10mL水，和陶瓷均质子涡旋 1 min， 静置 30 min 加入10mL乙腈，涡旋1 min， 加入 Bond Elut QuEChERS丙烯希胺萃取盐包(5982-5850) 涡旋或震荡 5 min， 9000 r/min 4℃ 低温离心 10 min 取 4mL 上层清液加入1mL水涡旋混匀后取3mL 直接过Captiva EMR 小柱300 mg 取 1mL流出液，40℃氮气吹至近干 1 mL流动相 (0.1%甲酸水)定容，过0.2 pm Captiva RC过滤膜 6470 LC-QQQ 检测 图1.奶粉样品前处理流程图 色谱条件 色谱柱： Agilent Polaris 3 Amide-C18，150×3.0 mm 柱温： 30°℃ 进样体积： 5pL流动相A： 0.1%甲酸水溶液流动相B： 乙腈 流速： 0.4mL/min 梯度： 见表1 表1.液相色谱梯度变化表 时间(min) B% 0 0 3 0 3.5 90 6.5 90 7 0 10 0 质谱条件 离子源： AJS ESI+ 监测模式： MRM 干燥气温度： 250°C 干燥气流速： 7L/min 雾化器压力： 40 psi 鞘气温度： 325°C 鞘气流速： 11 L/min 毛细管电压： 4000V 喷嘴电压： 0V 丙烯酰胺及内标的 MRM谱图：见图2 丙烯酰胺及内标的 MRM 参数：见表2 ×10413C-Acrylamide： +ESI MRM Frag=30.0V CID@10.0(73.0->56.0) std_20ppb.d 图2.丙烯酰胺及内标(10 ng/mL) 的 MRM 谱图 表2.化合物 MRM 参数表 化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(eV) 丙烯酰胺 72 55 30 10 44 30 13C-丙烯酰胺 73 56 30 10 色谱柱的选择 丙烯酰胺极性较强，出峰早，而常规 C18柱基本不耐受纯水流动相，一般文献中多采用 AQ 柱对丙烯酰胺进行分析。本文比较了 Agilent Poroshell 120 SB-Aq 2.7 um 3.0 mm x100 cm 色谱柱和Agilent Polaris 3 Amide-C18 150×3.0 mm 色谱柱。在用 SB-AQ色谱柱进行分析时，丙烯酰胺在1 min 左右出峰，极性干扰物对丙烯酰胺会有一定的干扰；选择 Polaris 色谱柱，丙烯酰胺的保留时间在 3.0 min 左右，再利用 Masshunter 采集软件流路切换功能并配合盐析前处理方法，可大大减小极性干扰物的影响，得到较高的回收率。 Captiva EMR-Lipid 的选择 评价了单独使用 QuEChERS 以及将 QuEChERS与 EMR 结合使用对样品的净化后基质效应。对于脂肪、蛋白质含量高的淀粉类食品仅采用 QuEChERS 盐包进行提取净化时，容易受到大量磷脂干扰，导致相应基质抑制效应增强，基质抑制率达到 47%。将QuEChERS 盐包与 EMR相结合，可以更好地去除极性干扰物，同时达到最大限度去除脂肪的作用，提高净化效果并降低基质效应，基质抑制率降低为30%。 因此，本文采用 QuEChERS 丙烯酰胺萃取盐包与 CaptivaEMR-Lipid 相结合进行样品前处理。 ×104 图 3.采用 Agilent Polaris 3 Amide-C18 150x 3.0 mm 色谱柱和 Agilent Poroshell120 SB-Aq 2.7 pm 3.0 mmx100 cm 色谱柱所得到的丙烯酰胺保留时间比较 图4.不同前处理方法基质效应的比较 线性范围与检测 丙烯酰胺在浓浓 2-200 ng/mL的范围内线性相关，且内标法线性相关系数>0.99。结果见图5。 图5.丙烯酰胺标准曲线 方法的回收率与精密度 分别取奶粉、饼干和薯片样品进行加标回收和精密度实验，添加10 pg/kg、20 pg/kg、50 ug/kg 三个浓度的标准品。在不同的加标浓度下，奶粉基质中的加标回收率在71.9%至80.2%之间，相对标准偏差 (RSD) 小于4.0%；饼干基质中的加标回收率在93.6%至104.8%之间， RSD小于4.5%；薯片基质中的加标回收率在75.9%至98.0%之间， RSD 小于 5.0%。结果如表3至表5所列。 表3.奶粉中丙烯酰胺回收率及精密度 样品 加标浓度 回收率 平均回收率 RSD 奶粉 10 pg/kg 71.6% 71.9% 2.43% 72.8% 70.2% 69.1% 76.1% 71.4% 20 pg/kg 76.6% 79.5% 3.75% 76.7% 86.7% 79.8% 78.1% 79.2% 50 pg/kg 77.3% 80.2% 2.69% 84.4% 78.2% 78.6% 80.7% 表4.饼干中丙烯酰胺的回收率及精密度 样品 加标浓度 回收率 平均回收率 RSD 饼干 10 pg/kg 88.3% 93.6% 2.43% 93.2% 94.9% 95.6% 94.6% 94.7% 20 pg/kg 91.7% 95.3% 4.5% 92.5% 99.0% 101.6% 96.8% 90.1% 50 pg/kg 102.5% 104.8% 3.2% 101.5% 106.4% 108.0% 102.0% 108.5% 表5.薯片中丙烯酰胺回收率及精密度 样品 加标浓度 回收率 平均回收率 RSD 薯片 10pg/kg 78.3% 75.9% 3.0% 77.1% 74.7% 76.5% 78.3% 70.4% 20 pg/kg 86.8% 89.3% 3.9% 88.9% 88.0% 96.4% 85.0% 90.6% 50 pg/kg 96.2% 98.0% 4.8% 95.3% 90.7% 103.1% 100.8% 实际样品分析 按照上述方法对市售品牌薯片(原味)、曲奇饼干样品进行分析，每个样品重复三次，结果如下： 样品名称 丙烯酰胺平均含量(pg/kg) 薯片1 246.2 264.0 873.6 薯片4 1624.3 样品名称 丙烯酰胺平均含量(pg/kg) 曲奇饼干1 115.7 曲奇饼干2 542.7 曲奇饼干3 630.1 曲奇饼干4 233.0 曲奇饼干5 99.4 曲奇饼干5 99.4 结论 本文建立了一种采用 Captiva EMR-Lipid 与 LC-MS/MS 相结合来测定食品中的丙烯酰胺残留的分析方法。该方法简便易用，重现性良好，且灵敏度满足GB 5009.204-2014 食品中丙烯酰胺定量限10 ug/kg的要求。 ( 参考文献 ) 1. GB 5009.204-2014食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定 2.采用 SampliQ QuEChERS AOAC 试剂盒及 LC/MS/MS分析炸薯条中的丙烯酰胺，安捷伦科技公司应用简报，出版号5990-5940CHCN， 2011 消耗品 部件号 Agilent Bond Elut QuEChERS 5985-5850 Agilent Captiva EMR-Lipid 300 mg， 3mL 5190-1003 Agilent Polaris 3 Amide-C18 150×3.0 mm 色谱柱 A2007150X030 Agilent Captiva RC 15 mm 0.2 pm 针头过滤器 5190-5096 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) ( 5994-1119ZHCN ) 本文介绍了一种结合 QuEChERS 和 Captiva EMR-Lipid 进行样品前处理，利用 LC-MS/MS 来分析食品中丙烯酰胺的方法。该方法简便易用，重现性良好，且灵敏度高，完全满足国际和国内标准对于食品中丙烯酰胺违禁物检测限的要求。