药物原料中杂质检测方案(气质联用仪)

实验条件表2.质谱参数 线性 Cristian Cojocariu and Paul Silcock Thermo Fisher Scientific， Runcorn， UK 关键词 药物活性成分，杂质，精确质量数，高分辨，QExactive GC 前言 药物杂质是指用于合成药物有效成分(API)的起始和中间原料中所含有的有害化学物质，此类物质即使含量极低，仍会影响药物产品的治疗效果并最终对患者造成健康威胁。通常，多数杂质是在 API 合成过程中产生或来源于与活性成分直接接触的包装材料。 目前，杂质分析(包括化合物检测、定性和定量)作为药物产品生产中的强制步骤受到包括人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)、美国食品药品监督管理局(FDA)在内的法规机构的严格关注。 起始和中间原料中所含有的杂质成分种类繁多、性质差异巨大，要对这些化学物质进行检测、定量和结构解析无疑是一个巨大的挑战。在各种应用于 API 中杂质检测分析的分析工具中，气相色谱联用质谱(GC-MS)通常用于检测药物成分生产过程以及终产物中的挥发性和半挥发性化学物质。 直到最近，使用 GC-MS 进行杂质分析还仅局限于传统的电子电离(EI)或化学电离(CI)结合单四极杆质谱系统。随着飞行时间质谱(TOF-MS)技术的发展，将高分辨精确质量数测定引入该类分析应用。②除了El和CI以外，，二飞行时间质谱仪还可与包括大气压化学电离(APCI)在内的软电离技术相结合，实现 GC-HRMS 分析。但是此类测试系统与真空 GC-MS 系统相比，线性动态范围狭窄，且具有较高的化学背景噪音。此外，通过 APCI-GC-MS 系统测试所获得的质谱图与现有的商业 化质谱谱库并不兼容，从而导致化合物鉴定困难。 样品制备 本次试验用于分析杂质的样品为一系列药物产品生产过程中常规使用的典型起始材料，既有固体化合物，也有液体化合物。样品的详细信息以及稀释溶剂详见表1。(3S)-3-甲基吗啉(SAFC@，布克斯，瑞士)、N，N，N’-三甲基乙二胺以及1，2-a咪唑并吡啶为液体样本，使用甲醇稀释为1%(v/v)的工作溶液。4-氟苯甲腈、3，5-二氟苯酚以及2，6-二氟溴苄为固体样本，采用OptimaTM LC/MS 级甲醇( Fisher Scientific，英国)制备浓度为100 pg/mL(w/v)的溶液备用。2，6-二氟溴苄样品进一步用甲醇稀释为2.5 pg/mL (w/v)。N，N，N’-三甲基乙二胺使用[DMSO (Fisher BioReagents， FisherScientific， Loughborough，英国)逐级稀释浓度至0.0001%(v/v)。 表1.分析所用样本。 API 物态 溶剂 工作溶液浓度 (3S)-3-甲基吗啉 液体 甲醇 1% v/v N，N，N’-三甲基乙二胺 液体 DMSO 1%v/v 1，2-a咪唑并吡啶 液体 甲醇 1% v/v 4-氟苯甲腈 固体 甲醇 100 ug/mL (w/v) 3，5-二氟苯酚 固体 甲醇 100 pg/mL (w/v) 2，6-二氟溴苄 固体 甲醇 100 ug/mL (w/v) 应用 QExactive GC Orbitrap GC-MS/MS质谱仪分析样品中的杂质。样品通过 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSHTM 自动进样器进样，并经由 Thermo ScientificTM TRACETM 1310气相色谱系统实现色谱分离。除 N，N，N’-三甲基乙二胺以外的其他样品均使用 Thermo ScientificTM TRACETM GOLD TG-5SilMS 毛细管色谱柱(30mx0.25 mml.D. ×0.25 pm film， P/N 26096-1420)，氦气流速为1.0 mL/min， 进样口温度为250℃，柱温箱升温程序以 20℃/min 的速度由50℃升至320℃。N，N，N’-三甲基乙二胺的杂质分析使用 Stabilwax@-DB气相色谱柱(30m×0.32 mm x 0.5 um， Restek@)， 氦气流速为 1.0 mL/min，进样口温度为250℃，气气相色谱柱温箱由50℃保持10分钟后以 45℃/min 的速度升至200℃。进样体积为1uL，分流比设置为 40：1。EI 源电离能量为 70eV， 源内以及传输线温度均为250℃。正化学电离(PCI)测试采用甲烷为反应气体，流速为1.0 mL/min。使用背景离子作为锁定质量进行内标质量校正(m/z 207.03235)(表2)。 Q Exactive GC 质谱仪参数 传输线温度(℃)： 250 离子化： EI & CI 离子源： 250(EI) &185 (PCI) 电离能量(eV)： 70 数据采集模式： 全扫描 质量范围(Da)： 50-750 质量分辨率 (m/z 200处FWHM)： 60000 质量锁定，柱流失(m/z)： 207.03235 采集高分辨一级全扫描数据并应用 Thermo ScientificTMTraceFinderTM软件进行自动峰检测、谱图解卷积、元素组成推测以及定量分析等数据处理。 化合物自动检测与鉴定工作流程 采用仪器默认质量分辨率60，000(FWHM，在 m/z 200 处)对每个样品进行一级质谱全扫描分析。将 El数据与现有的商业化谱图(NIST)进行匹配，对化合物进行初步鉴定，并通过以甲烷作为反应气体的正化学电离数据确认化合物的分子离子峰。除此之外，我们还采集了 PCI 的 MS/MS 数据以却确认检测到杂质的化学结构。所有样品分析前均测试一针空白溶剂，以作为数据对照(样品与空白溶剂比较)的参考背景。图1 展示了(3S)-3-甲基吗啉样品的总离子流色谱图(TIC)。 通过对El 和 PCI 数据的分析，推测出起始和中间原料所有物质成分的分子离子峰，质量偏差均小于1ppm(表3)。 应用 TraceFinder 软件中的谱图解卷积功能， 在各 TIC 中精确找出含量高于 0.1%的杂质峰(依据 ICH 规范要求)，并生成扣除背景干扰的质谱图。TraceFinder软件还可通过其特有的高分辨过滤(HRF)打分来根据精确质量数优化谱图检索结果。每个化合物的谱库匹配结果均有一个相应的 HRF 打打，该分数代表与谱库匹配的化合物标准谱图相比，样品测试谱图中可解释的离子相对数量。4图2为样品(AZ15june001)数据中检测到，而空白溶剂样品(AZ15june000)数据未检测到的化合物 4-苯氟甲腈，如下是该化合物检测和鉴定的流程示例。将解卷积谱图(e)与 NIST 库库(d)匹配以进行化合物鉴定，并通过精确质量数和元素组成(f)来进一步确认谱图匹配结果(b)。 1，2RT：2.12-8.43 SM： 3B 3NL：100- 4.32 1.00E8TIC MSAZ11june0206 a5462.133.835.872.513.912.632.93 3.09 3.394.43 4.49 4.68 5.065.28 5.57 5.966.236.29 6.516.786.92 7.15 7.28 7.62 7.788.03 8.394.43 NL：100=V227 5.05 6.23 1.00E8TIC MS903 2.44 AZ 0592.47802.87 2.88 2.91b70 2.663 3 .22 WA3043.79.603.27 3.854.134.74503.95 5.4514.524.97 5.146.8740- 6.73 5.585.99 6.46 6.917.387.637.767.96 8.00^w 8.078.432.20NL：100=12.271.00E8TIC MS903 AZ 05880 2.572.87 2.924.43 C70 3.6836052 .99 3 5.4.273.58 4.806.47 8.1950-37.95.384.17 4.824.495.17 5.865.9140一6.78 6.86 5.73 6.02 6.37 6.88 7.367.6337.69 8.068.43TT4TTT TTTT TTTTTTTTT mmTTTTT TT 一2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time (min) 图1.(3S)-3-甲基吗啉样品柱上样浓度为 10 pg/mL (w/v)的总离子流色谱图中主成分(1)和几种含量高于0.1%的主要杂质(2-6)的离子流峰。在质量分辨率设置为60，000 ( FWHM， 在 m/z 200 处)的全扫描模式下采集El(a)和PCI(b) 的数据。测试空白溶剂样品(甲醇)作为参照背景。 表3.通过精确质量数确认测试样品中的化合物成分的分子离子峰。应用PCI数据对El 数据进行确认。表中展示了化合物化学结构及其与理论精确质量数偏差值(△ppm)。 药物活性成分 精确质量理论值(EI) 精确质量实测值(EI) Appm 精确质量理论值(PCI) 精确质量实测值(PCI) Appm (3S)-3-甲基吗啉NH -CCH3 化学式=CHNO 101.08352 101.08358 0.6 102.09134 102.09136 0.2 4-氟苯甲腈 化学式=C，HFN 121.03223 121.03223 0.0 122.04005 122.04012 0.5 3，5-二氟苯酚 化学式=CHF，O 130.02247 130.02256 0.7 131.03030 131.03032 0.2 2-溴甲基-1，3-二氟苯 化学式=C，H，BrF， 204.94625 204.94608 -0.9 206.96155 206.96162 0.3 1，2-a咪唑并吡啶 化学式=CHN 118.05255 118.05256 0.1 119.06037 119.06038 0.0 N，N，N’-三甲基乙二胺 CH3NH- CH3H3C 化学式=C，HN， 102.11515 102.11520 0.5 103.1073 103.12300 0.3 图 2.应用 TraceFinder 软件对4-苯氟甲腈样品中的杂质进行检测和鉴定的示例。通过结合 TIC 谱图解卷积、谱库检索、HRF评分以及其他标准实现智能化合物鉴定流程。 在(3S)-3-甲基吗啉样品中检测到多种杂质。通过解卷积软件推测杂质可能的化学结构，并应用PCI数据进一步确认。 表4展示了El和PCI模式检测到的化合物分子离子的实测精确质量数与理论质量数的偏差值。所有精确质量测定值偏差均小于1 ppm， 这样可以有效减少在最常见化学元素范围 (C、H、O、N、S和P)内可能的元素组成数量。推测出(3S)-3-甲基吗啉样品中检测到的所有杂质(包括未能实现基线分离的杂质)的化学结构式，这些杂质被认为是由生产过程中产生或引入的。 表4. (3S)-3-甲基吗啉样品中检测到的主要杂质分子离子的精确质量数。数据是在 EI 和 PCI模式下质量分辨率设置为60，000(FWHM， 在 m/z 200处)。 保留时间(min) 化合物编号 精确质量数理论值(EI) 精确质量数实测值(EI) △ppm 精确质量数理论值(PCI) 精确质量数实测值(PCI) Appm 3.55 H H CH3 (3S)-3-甲基吗啉化学式=CHNO 101.08352 101.08358 0.6 102.09134 102.09136 0.2 3.75 ch3= .CH3 化学式=C，H1，NO 115.09917 115.09925 0.7 116.10699 116.10703 0.4 4.32 H3C CH3 化学式=C，HgNO 129.11482 129.11486 0.4 130.12264 130.12268 0.3 5.06 CH3 CH3 O 化学式=C.HNO 155.13047 155.13048 0.1 156.13829 156.13825 0.3 5.87 CH3 .CH3 化学式=CHNO， 129.07843 129.07843 0.0 130.0862 130.08634 0.3 6.23 ，CH3 .CH3 化学式=C，H，NO， 143.09408 143.09414 0.4 144.10193 144.10193 0.2 表5.在El和 PCI 模式下、质量分辨率设置为 60，000 (FWHM， 在 m/z 200 处)时， N，N，N’-三甲基乙二胺样品中检测到的杂质的精确质量数。 保留时间(min) 化合物编号 精确质量数理论值(EI) 精确质量数实测值(EI) Appm 精确质量数理论值(PCI) 精确质量数实测值(PCI) Appm 2.79 CH3 H3C.CH3CH3 化学式=CHIN 116.13080 116.13085 0.5 n.d. n.d. n/a 3.20 H3C N—CH3 H3C一NH 化学式=C，HAN， 102.11515 102.11520 0.5 103.1230 103.12300 0.3 3.67 H CH3化学式=C，HN， 99.09167 99.09171 0.4 101.10730 101.10733 0.1 4.52 H H3C、`cH3H化学式=CHN 113.10730 113.10736 0.3 115.1230 115.12311 1.2 5.00 H3C CH3化学式=CHN 114.1151 114.11524 0.8 115.12298 115.12304 0.5 12.4 CH3 H3C一N N—CH3 H3C-NCH3 化学式=C，H28N， 173.18865 n.d. n.a. 174.19647 174.19658 0.6 通过 PCI-MS/MS 测试进一步确认各杂质可能的化学结构。为达到此目的，我们筛选出各杂质的质子化分子离子，并使其在更高能量碰撞诱导解离 HCD 碰撞池内以15V能量进行碎裂分析。通过评价产物碎片离子与推测化学结构可能产生的碎片 是否相符，并结合精确质量数信息，完成化合物化学结构的准确推导。图3为(3S)-3-甲基吗啉样品中检测到的两种杂质的PCI-MS/MS 谱图示例。 图3.色谱保留时间分别为 RT=3.7 min (a) 和RT=5.06 min (b) 的杂质的 PCI-MS/MS 谱图。 相关规定通常要求检测用于 API 生产的起始和中间原料中杂质的含量，这就需要对样品进行定量分析。因此，我们测试了应用Q Exactive GC 系统进行化合物定量分析的线性范围以及不同质量分辨率下的扫描点数。 下图展示了 N，N，N’-三甲基乙二胺的线性。其中， N，N，N’-三甲基乙二胺经El源电离测试，并积分计算 m/z 102.11515(分子离子)的峰面积，测得线性动态范围为0.0001到0.1250%(v/v，溶解于DMSO)，线性相关系数 r2>0.9996(质量分辨率在 m/z 200 处为60，000)。值得注意的是，在各个浓度水平下，化合物的质量精度均小于 1.1 ppm(图4)。 图 4.N，N，N’-三甲基乙二胺在王0.0001 到」0.1250%(v/v， 溶解于 DMSO)浓度范围内的线性。通过计算定量离子(m/z102.11515)提取离子流色谱峰的相应峰面积，图中展示了线性回归的相关系数(r2)以及各浓度水平的质量精度。测试数据是采用El源电离，质量分辨率设置为60，000 FWHM (在 m/z 200处)。 快速的扫描速度和稳定的质量精度 可信的杂质定量是基于准确的峰面积积分计算，而这与整个色谱峰的扫描点数直接相关。为了证明Q Exactive GC 系统即使在最高质量分辨率设定下，仍然具备足够的扫描描度，2，6本次测试采用二氟溴苄进行相关测试实验。在不同的质量分辨率设定条件下，采用 PCI 一级全扫描模式分析浓度为2.5 pg/mL(w/v) 的标准溶液。在当前色谱条件下，主成分的色谱峰 峰宽为3秒。图5展示了不同质量分辨率条件下，同一色谱峰的扫描点数的变化，即使在最高质量分辨率(120，000 FWHM在 m/z 200 处)下，仪器仍然能够采集到足够的扫描点用于准确的峰面积积分计算。此外，图6展示了在质量分辨率为60，000 时，色谱峰中每个扫描点的质量精度，所有点均保持稳定良好的质量精度，偏差均小于 0.3 ppm。 图5.在超高质量分辨率设定下，每个色谱峰仍可达到足够的扫描点数。即使对于峰宽仅3秒的色谱峰(2，6-二氟溴苄， m/z127.03583的提取离子流基峰图)，仪器在超高质量分辨率条件下仍可保持足够的扫描点数，以确保峰面积积分的准确性。数据采集自以甲烷为反应气体的 PCI电离模式下。 图6.在El源电离、质量分辨率为60，000 FWHM 条件下，一个峰宽约为3秒的色谱峰((3S)-3-甲基吗啉样品中保留时间为 5.06min 的杂质峰)的扫描点示例。红色标注为每个扫描点的质量偏差(ppm)。图中还标明了计算质量偏差的 RMS 以及单个峰的总扫描点数。 ·本文评价了 Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap 质谱仪针对用于药物活性成分生产的起始和中间原料中所含有的杂质进行定性和定量的测试能力。 ( ·应用 TraceFinder 软件进行自动峰检测、谱图解卷积和推测杂质化学结构分析。最重要的是，本次实验中化合物的化学结构鉴定在参考 NIST谱图库的碎片离子合理化匹配度评分之外，还采用了精确质量信息推测化合物的元素组成。 ) ( ·绝佳的系统灵敏度结合宽动态范围的特性，使得 Q ExactiveGC 质谱仪可同时检测低浓度和高浓度水平的杂质，同时实现亚-ppm 级质量精度常规化，准确推算未知化合物的元素组成。除了以上性能特征，实验人员还可通过 MS/MS 测试进一步确认样品中检测到的杂质的化学结构。 ) ( ·扫描速度完全符合气相色谱峰的要求，即使是在最高质量分 辨率120，000条件下，仍可不受高化学背景噪音干扰，实现 良好的质谱峰提取，并对化合物进行可信的定量分析。 ) ( ·Q Exactive GC 系统作为一种通用型分析工具可快速完成El和PCI测试，这使得本分析平台在制药工业的研究和开发领域具有强大的应用优势。 ) ( 参考文献 ) ( 1 . Keitel S. Impurity Profiles in Activ e PharmaceuticalIngredients.EU / Swissmedic GMP Workshop BeijingUniversity. 2006 Sep. ) ( 2.C. P etucci， L. Mallis. Automated accurate mass dataprocessing u sing a gas chromatograph/time-of-flight massspectrometer in drug discovery. Rapid C ommunications inMass Spectrometry， 2005， 19，1492. ) ( 3. T . Bristow， M. Harrison， M. Sims. T he application o f gaschromatography/atmospheric pressure chemical lonizationtime-of-flight mass s p ectrometry to impurity identificationin Pharmaceutical Development. Rapid Communications inMass Spectrometry， 2010， 2 4 ， 1 6 73. ) ( 4 . N. W. K wiecien， D.J. B ailey， M.J.P.Rush， J.S. Cole， A.Ulbrich， A.S. Hebert， M.S. Westphall， J .C. C oon. High-resolution filtering for improved small molecule identificationvia GC/MS. Analytical Chemistry，2015，87，8328-8335. ) ( 5. S. Baldwin， T. Bristow， A . Ray， K. Rome， N. Sanderson，M. S ims， C . I. Cojocariu， P.J. S i lcock. 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RapidCommunications in Mass Spectrometry， 2016， in press. ) SCIENTIFIC A Thermo Fisher Scientific Brand 药物杂质是指用于合成药物有效成分（API）的起始和中间原料中所含有的有害化学物质，此类物质即使含量极低，仍会影响药物产品的治疗效果并最终对患者造成健康威胁。通常，多数杂质是在 API 合成过程中产生或来源于与活性成分直接接触的包装材料。目前，杂质分析（包括化合物检测、定性和定量）作为药物产品生产中的强制步骤受到包括人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）、美国食品药品监督管理局（FDA）在内的法规机构的严格关注。起始和中间原料中所含有的杂质成分种类繁多、性质差异巨大，要对这些化学物质进行检测、定量和结构解析无疑是一个巨大的挑战。在各种应用于 API 中杂质检测分析的分析工具中，气相色谱联用质谱（GC-MS）通常用于检测药物成分生产过程以及终产物中的挥发性和半挥发性化学物质。直到最近，使用 GC-MS 进行杂质分析还仅局限于传统的电子电离（EI）或化学电离（CI）结合单四极杆质谱系统。随着飞行时间质谱（TOF-MS）技术的发展，将高分辨精确质量数测定引入该类分析应用。 除了 EI 和 CI 以外，飞行时间质谱仪还可与包括大气压化学电离（APCI）在内的软电离技术相结合，实现 GC-HRMS 分析。但是此类测试系统与真空 GC-MS 系统相比，线性动态范围狭窄，且具有较高的化学背景噪音。此外，通过 APCI-GC-MS 系统测试所获得的质谱图与现有的商业化质谱谱库并不兼容，从而导致化合物鉴定困难。本次实验主要展示了应用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ GCOrbitrap™ GC-MS/MS 系统对药物有效成分合成过程中涉及的多个小分子有机化合物（及其相关杂质）进行检查和结构解析的能力。实验表明，Q Exactive GC 质谱仪所具备的高质量分辨率以及在宽浓度范围内实现常规精确质量数测定的能力，并可轻松提供可信的定量分析结果。本仪器出众的分析能力结合自动化的化合物检测、鉴定和定量工作流程，组成了用于活性药物成分生产中起始和中间原料杂质分析的理想工具。整个分析过程采用电子电离进行高分辨质谱一级全扫描精确质量数测定，并通过化学电离确认推测化合物的分子离子峰，在宽浓度范围内对化合物进行定量分析。本次研究中所展示的数据是与制药行业合作伙伴共同发表。