宠物食品中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

报 告 黄曲霉毒素是已知最致癌的真菌毒素之一，被分为 B1、B2、Gi和 G2。黄曲霉毒素是由作物或收割后接触暴露在潮湿或温暖的环境中的情况下，由黄曲霉、模式曲霉和寄生曲霉真菌的产毒菌莉所产生。黄曲霉毒素B1被认为是霉菌毒素中最具遗传毒性的毒素，当农场动物摄入此毒素时，会污染人类食用的乳制品、蛋类和肉类产品。1 在过去几年中，多起商业宠物食品中黄曲霉毒素事件暴发。黄曲霉毒素暴露的症状包括嗜睡、厌食、黄疸和血管内凝血，其严重程度通常根据宠物的品种、种类、年龄、剂量、暴露时间和营养状况而有所不同。?即使只影响一小部分商业宠物食品，宠物食品安全问题也会因召回和消费者忠诚度下降而影响整个宠物食品行业。。这些经验再次证明了商业宠物食品生产商需要投入大量资源来记录产品质量。? 美国食品药物监督管理局(FDA)规定谷物中原始霉菌毒素的控制限量为 20ppb， 而欧盟标准则更严格，规定为 10ppb。某些商业宠物食品中痕量黄曲霉毒素通常约为 1-2ppb。3柱后衍生化通常用于利用反相分离和荧光(FL)检测器检测来增强黄曲霉毒素分析物在这些水平下的响应。 此应用中，我们介绍了一种监测 ppb 至ppt 水平 Bi、B2、Gi和Gz 黄曲霉毒素的技术，该技术无需柱后衍生化。该方法使用简单的固相萃取(SPE)技术进行样品净化，然后使用亚3pm色谱柱分离结合荧光(FL)检测器进行UHPLC分析。 实验 硬件/软件 采用 PerkinElmer AltusTM UPLC@系统，其中包括 A-30 进样和溶剂输送模块(四元泵)、柱温箱、A-30 PDA (二极管阵列)和荧光检测器(美国康涅狄格州谢尔顿市， PerkinElmer)。所有分离均采用 PerkinElmer BrownleeTM SPP C18 2.7um，3.0x100mm色谱柱完成(美国康涅狄格州谢尔顿市，PerkinElmer)。所有仪器控制、分析和数据处理均采用Waters@ Empower3色谱数据软件(CDS)完成。 方法参数 UHPLC方法参数如表1所示。 溶剂、标准品和样品 所用的所有溶剂和试剂均为 HPLC 级并利用 0.45um 滤膜进行过滤。 20ug/mL (20ppm)黄曲霉毒素标者储备液选自Sigma-Aldrich@Inc. (宾夕法尼亚州艾伦镇)，为黄曲霉毒素Bi、B2、Gi和Gz乙溶液。通过在 10.0mL 稀释剂中添加10ul标准储备液来制备 20ppb的工作液。通过在25.0mL稀释剂中添加2pL黄曲霉毒素标准储备液制备 1.6ppb的工作液。 表1. UHPLC 方法参数。 液相色谱柱： PerkinElmer Brownlee SPP C18， 2.7 um， 3.0x100-mm(货号： N9308410) 固相萃取柱： SupelTM Tox AflaZea， 6-mL， (货号：55314-U)，Sigma-Aldrich@Inc.(宾夕法尼亚州艾伦镇) 流动相： 溶剂A： 0.1%甲酸水溶液 溶剂B：50%甲醇，50%乙腈中添加0.1%的甲酸 溶剂程序： 时间(min) 流速(mL/min) %A %B 1 初始 0.5 70.0 30.0 2 4.5 0.5 40.0 60.0 3 4.6 0.5 5.0 95.0 4 4.8 0.5 5.0 95.0 5 5.0 0.5 70.0 30.0 分析时间： 4.0 min；淋洗/平衡时间=6.0 min 流速： 0.5mL/min (约5000 psi 最大压力) 柱温箱温度： 35℃ PDA检测： 波长：360nm 荧光检测器： 激发 (Ex)： 365nm， 发射(Em)： 425nm； Bi 和Bz定量 激发 (Ex)： 365nm， 发射 (Em)： 450nm； G和Gz定量 进样量： 10uL 采集(数据)速率： 10 pts./sec 稀释剂： 80：20乙腈/水 商业宠物食品选自当地商店。将大约 30g宠物食品磨成细粉，然后称取25.0g倒入锥形烧瓶中，以制备宠物食品提取物。量取 8pL的 20pg/mL 黄曲霉毒素标准储备液加入粉末中，以制备 1.6ppb 的加标宠物食品。加入 100.0mL 稀释剂并将烧瓶旋转一小时。重复此步骤但不再添加黄曲霉毒素标准品，以制备未加标宠物食品提取物。 为在进样前净化样品，分别取2.0mL 的 1.6ppb 工作标准液、加标提取物和未加标提取物加入单独的AflaZea 固相萃取柱，并使用真空泵使其快速通过。分析前，量取200uL 洗脱液添加到880uL 的 HPLC 级水中并手动摇晃进行昆合。根据1.6ppb 工作标准品的响应计算了狗粮和猫粮中黄曲霉毒素加标物的回收率。 图1显示了利用 PDA和荧光检测器获得的20ppb 黄曲霉毒素标准混合物色谱图，混合物中包含 B1、B2、G1和 G2。利用PDA检测器在360nm 波长处获得上半部分色谱图(A)；利用荧光检测器在 Ex 365nm/Em 425nm 波长处获得下半部分色谱图(B)。在不到 4min 的时间里完成了黄曲霉毒素的分离。 图1.20ppb标准溶液的 UHPLC 色谱图显示了：(A)PDA检测器：360nm波长；(B)荧光检测器： Ex 365nm/Em 425nm 波长。 如图2所示，利用荧光检测技术通过10次进样 1.6ppb标准品证实了色谱重复性，从而证明了出色的重现性。所有峰保留时间的%RSD 小于0.2%。 图2.荧光检测器获得的10 次重复进样 1.6ppb 黄曲霉毒素工作标准液的重叠图。 PDA 和荧光检测器均测定了 ppb 水平黄曲霉毒素 B1、B2、Gi和Gz的线性。Bi和Gz的代表性校准曲线如图3和图4所示。 如表2中所列，每种黄曲霉毒素的定量限和检测限分别依据信噪比大于10/1和3/1确定。采用 PDA 检测器，黄曲霉毒素B1、B2、G1和 Gz 可定量至 3ppb。采用荧光检测器，黄曲霉毒素 Bi、Bz 和 Gz 可定至至600ppt。针对黄曲霉毒素 G1， 荧光检测器测得的定量限约为 2ppb。 表2.黄曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2的定量限和检测限。 黄曲霉毒素 PDA测得的定量限 (ppb) PDA测得的 荧光检测器测得 荧光检测器测得的检测限 (ppb) 检测限 (ppb) 的定量限(ppb) G 3.39 1.02 0.11 0.03 G 3.43 1.03 2.18 0.65 B， 2.68 0.80 0.53 0.16 B 2.43 0.73 0.07 0.02 图5和图6中重叠色谱图显示了利用荧光检测器检测 1.6ppbB1、B2、G1和Gz加标的宠物食品。1.6ppb 加标的回收率介于70-120%之间(表3)。 图 3.利用 PDA 在360nm 波长处检测的 B1 浓度介于5-50ppb 之间的线性曲线(A)以及利用荧光检测器检测的浓度介于 1.6-8ppb 之间的线性曲线(B)；此方法规定了 Ex 和 Em 波长。 图4.利用 PDA 在 360nm 波长处检测的 Gz 浓度介于 5-50ppb 之间的线性曲线(A) 以以及利用荧光检测器检测的浓度介于 1.6-8ppb 之间的线性曲线(B)；此方法规定了 Ex 和 Em 波长。 宠物食品中 1.6ppb Bi、B2、G1和 Gz分析物基表回收率介于70-120%之间(表3)虽然1.6ppb 加标黄曲霉毒素水平稍稍低于 G1 计算的定量限，回收率在100-121%的可接受水平。 尽管未显示，但未加标狗粮和猫粮中未观察到检测出的黄曲霉毒素。 表3.荧光检测器检测测得的 1.6ppb 加标狗粮和猫粮回收率结果(n=2) 样品 B(%) B(%) G(%) G(%) 猫粮 82.3 84.7 120.7 70.2 狗粮 93.5 94.7 100.4 79.2 结论 本研究证明了可利用PerkinElmer Altus UPLC系统和A-30PDA 和荧光检测器对黄曲霉毒素 B1、B2、G1和 Gz 进行有效色谱分离和定量分析。结果显示了每种黄曲霉毒素在测试浓度范围内具有出色的线性。 尽管分析的宠物食品均未显示出有任何检测出的黄曲霉毒素，加标物回收率证明了 A-30荧光检测器能够对 ppb 水平的黄曲霉毒素 B1、B2、Gi和Gz进行检测，且无需进行衍生化。 ( 参考文献 ) ( 1 . Hudler， George W.， Magical Mushrooms， Mischievous Molds：The Remarkable S t ory of the Fungus Kingdom and Its Impact onHuman A f fairs， 1998. ) ( 2. Simone A q uino an d Benedito Correa， "Af l atoxins in Pet Foods：A Risk to Special Consumers"， Aflatoxins- Detection，Measurements and Control，2011. ) ( 3 . h ttp：//www.poisonedpets.com/top-us-pet-food-brands-test-positive-for-aflatoxin-melamine-and-cyanuric-acid/. ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 有关我公司完整的全球办事处设立情况，请访问www.perkinelmer.com/ContactUs ( 版权C2015， P erkinElmer，Inc. 版权所有。 PerkinElmer是 PerkinElmer，Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 ) 此应用中，我们介绍了一种监测ppb 至ppt 水平B1、B2、G1 和G2 黄曲霉毒素的技术，该技术无需柱后衍生化。该方法使用简单的固相萃取（SPE）技术进行样品净化，然后使用亚3μm 色谱柱分离结合荧光（FL）检测器进行UHPLC 分析。