动物源性食品中孕激素类药物残留检测方案(液质联用仪)

结论 动物源性食品中孕激素类药物残留LC-MS/MS分析方法 背景 近年来，食品安全事件频发，人们对食品 中激素类残留尤为关注。孕激素类药物在畜禽养殖中可以提高饲料转化率，促进动物生长等作用，畜牧业中非法滥用孕激素类药物问题十分严重。我国农业部176号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇，左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，并在235号公告规定了甲羟孕酮等在动物源性食品中不得检出。 样品前处理方法提取 称取3g(精确至0.01g)混匀的试样，置于50mL具塞离心管中，加入5 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，涡旋混匀，再加入β-葡萄糖醛酸/芳香基硫酸酯酶溶液60 uL， 于37℃±1℃振荡酶解12h。取出冷却至室温，加入20 mL乙腈涡旋 5 min， 超声提取10min， -10℃下10000 r/min 离心5 min， 将上清液转入另一个干净的50mL离心管中，加入20mL正己烷-二氯甲烷 (v/v， 80：20)，振摇5 min， 静置后，溶液分成上中下三层，吸取中间层(乙腈+二氯甲烷)溶液于梨形蒸发瓶中，40℃减压旋蒸至干，加入0.5mL乙腈， 5mL水，混匀后待净化。 净化方法 ①固相萃取柱的准备： 将C18固相萃取柱(500 mg，3 mL)置于固相萃取装置上，依次用6mL甲醇和6mL水活化。 ②样品净化： 将上述样品提取液转移至活活过的C18固相萃取柱，控制流速约1滴/秒。依次用5 mL10%甲醇水溶液和5 mL水淋洗小柱，淋洗液完全通过小柱后，加压抽至干，用6mL甲醇洗脱，收集洗脱液于梨形蒸发瓶中，在40℃真空旋转蒸发至近干，再用氮气流下吹干，加入0.5 mL乙腈溶解残渣，涡旋混合1min， 加入0.5mL水，混匀，过0.22 pm滤膜，供LC-MS/MS 测定。 LC-MS/MS 仪器方法 液相色谱参数 液相色谱仪： PerkinElmer AltusM A-30 UPLC系统，具体参数见表1。 液相色谱流动相：A：乙腈 色谱柱： (min) PerkinElmer SPP C18 2.1*50 mm， 2.7 um (货号： 流速 (mL/min) %A %B 1 0 0.3 25 75 2 2.5 0.3 60 40 3 4.0 0.3 98 2 4 5.5 0.3 98 2 5.6 0.3 25 75 6 7.0 0.3 25 75 色谱柱： N9308402) 分析时间： 7 min 柱温： 35°℃ 进样量： 10uL 质谱参数 以下参数以 PerkinElmer QSightM 200 系列为例，孕激素类化合物质谱参数见表2和表3. 表2.化合物质谱参数列表 化合物 英文名 CAS 号 离子对信息 EV/V CE /eV 驻留 时间 /msec 炔诺酮 19-norethindr-one 68-22-4 299.1/108.9* 37 -40 30 299.1/231 -25 30 21a-羟基孕酮 21 a-hydroxy-progesterone 64-85-7 331/109.1* -38 30 39 -31 30 331/97.1 17α-羟基孕酮 17 a-hydroxy-progesterone 68-96-2 331/109.1* 32 -41 30 331/97.1 -24 30 甲基炔诺酮 D-(-)-Norgest-rel 797-63-7 313/245.1* 35 -24 30 313/108.9 -41 30 甲羟孕酮 Medroxyprog-esterone 520-85-4 345/123.1* 38 -36 30 345/97.2 -41 30 乙酸氯地孕酮 Chlormadino-neacetate 302-22-7 405/345.0* 34 -18 30 405/308.9 -21 30 孕酮 Progesterone 57-83-0 315/109.1* 39 -40 30 315/97.0 -33 30 甲羟孕酮乙酸酯 Medroxyprog-esterone-17- acetate 71-58-9 387/327.0* 30 -20 30 387/285.1 -25 30 注：*为定量离子： EV 为入口电压； CE 为碰撞能量 表3.质谱离子源参数 离子源 电喷雾，正离子模式(ESI+) 离子源喷雾电压/ 5500 离子源温度/℃ 500 HSID 温度/℃ 320 雾化气 160 干燥气 50 实验结果 按照上述建立的实验条件，获得孕激素类的色谱图，见图1。其中各孕激素类化合物的信息、保留时间见表4。 图1.孕激素标准溶液浓度为 0.05 ng/mL 的提取离子流色谱图 表4.图1中孕激素类化合物信息和保留时间 序号 化合物 保留时间 /min 1 炔诺酮 3.76 2 21α-羟基孕酮 3.83 3 17α-羟基孕酮 4.06 4 甲基炔诺酮 4.26 5 甲羟孕酮 4.44 6 乙酸氯地孕酮 4.83 7 孕酮 4.85 8 甲羟孕酮乙酸酯 4.87 将标准溶液配制成工作液，使各个化合物浓度为0.1~100ng/mL， 在本方法确定的实验条件下，获得标准曲线数据。以进样浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，建立标准曲线(图2及表5)。由表5可见，各分析物标准曲线的相关系数均大于0.99，相关性良好。在低浓度水平 0.1 ng/mL下进行重现性实验，在连续6针进样下，获得优异的重现性结果，见表5。 图2.孕激素化合物中21α-羟基孕酮的标准曲线示例，标准曲线范围：0.1-100 ng/mL 表5.孕激素类化合物的标准曲线、线性关系以及重现性数据(0.1ng/mL) 化合物 标准曲线 范围 ng/mL 相关系数R 在0.1 ng/mL浓度下 重现性 n=6 炔诺酮 0.1-100 0.999 5.53% 21α-羟基孕酮 0.1-100 0.998 3.87% 17α-羟基孕酮 0.1-100 0.999 3.06% 甲基炔诺酮 0.1-100 0.999 2.05% 甲羟孕酮 0.1-100 0.999 2.52% 乙酸氯地孕酮 0.1-100 0.993 6.02% 孕酮 0.1-100 0.996 3.75% 甲羟孕酮乙酸酯 0.1-100 0.994 6.67% PerkinElmer QSight 200系统具有灵敏度高、重现性好、抗污染能力强等优点，在检测动物源性食品中孕激素残留完全满足食品安全最严格的法规要求。 ( 参考文 献 ) 1.出入境行业标准 SN/T 1980-2007 色谱柱订购信息 PerkinElmer SPP系列色谱柱订购信息：色谱柱采购直线： 021-60645658，021-60645659 电子邮件： consumable.china@perkinelmer.com 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海每江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs版权所有 ◎ PerkinElmer， Inc.保留所有权利。PerkinElmer 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 近年来，食品安全事件频发，人们对食品中激素类残留尤为关注。孕激素类药物在畜禽养殖中可以提高饲料转化率，促进动物生长等作用，畜牧业中非法滥用孕激素类药物问题十分严重。我国农业部176 号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇，左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，并在235 号公告规定了甲羟孕酮等在动物源性食品中不得检出。本文将介绍动物源性食品中孕激素类药物残留LC-MS/MS分析方法。