单胞菌蛋白组酶中蛋白组学中的定量验证检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 实验结果 TSQ Altis全新三重四极杆全面提升蛋白组学中的定量验证能力 黄敏，周岳赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： TSQ Altis，定量验证，蛋白组学 1前言 生物标志物的开发过程主要包括三个阶段，即发现、验证和确认。随着研究人员在发现阶段积累了大量数据之后，需要对发现阶段得到的差异表达蛋白进行验证和确认，从而推动生物标志物的开发，这就需要对目标蛋白进行定量实验。一般而言，定量实验包括相对定量和绝对定量两个水平，相对定量可以进一步验证差异蛋白的表达变化，绝对定量可以确认目标蛋白的绝对含量。这两种定量实验都需要在成分复杂的生物样品中完成，要求仪器必须具备高灵敏度高稳定性，以确保低丰度蛋白的检出和准确定量。 TSQ Altis是赛默飞世尔科技在2017年ASMS推出的全新一代三重四极杆质谱仪，采用了增强型主动离子管控( Active lonManagement， AIM+)技术优化从离子源至检测器的离子传输、消除主要噪声源、精确隔离待测物，最终获得了极限定量性能。我们利用TSQ Altis 在复杂基质中针对目标蛋白和肽段分别进行相对定量和绝对定量的定量验证能力考察。其中，相对定量所得的定量结果与前期发现阶段用高分辨Orbitrap所得的差异变化方向一致；绝对定量实验中，目标肽段LOQ达到柱上1.67amol， 并实现4个数量级的线性范围。 实验材料和方法 相对定量样品：3组(G， C16，C24)假单胞菌蛋白组酶解样品，每组2个，一共6个。需对其中的两个差异蛋白(FadL和PA1767)进行相对定量。 绝对定量样品：在假单胞菌蛋白组酶解样品中掺入目标肽段得到两个不同浓度的样品，分别为2-6和2-7，其浓度范围约10amol~1fmol/ul。在对样品中的目标肽段进行绝对定量时，用BSA作为基质配制标准曲线，然后用外标法对实际样品中的目标肽段进行定量。 纳升液相色谱质谱联用(nano LC-MS) 高效液相色谱仪： Thermo ScientificEasy-nLC 11200；色谱柱：相对定量采用C18，2 pm， 100A， 75 pm x25 cm， PN164941，绝对定量采用C18-AQ (ReproSil-Pur 120)， 3pm， 120A， 75 pmx10cm；流动相：A： 0.1% Formic acid inwater； B： 0.1% Formic acid in 80% acetonitrile；梯度：相对定量60min(从3%洗脱至30%)，绝对定量20min(从10%洗脱至30%)；流速：300nL/min. 质谱仪： Thermo ScientificTSQ Altis三重四极杆质谱仪；喷雾电压：2.2kV；毛细管温度：320)℃；分辨率设置：Q1设置0.7FWHM，Q3设置0.7FWHM；扫描方式：MRM； Cycletime：1.5s。 数据分析 所有肽段定量的数据分析均采用skyline软件完成，目标蛋白相对定量实验中采用Proteome discoverer 2.2软件先进行目标蛋白的鉴定，并根据肽段丰度选择定量肽段。 1相对定量中定量肽段的选择 先采用Orbitrap对样品进行DDA分析， PD软件鉴定后，对FadL和PA1767所鉴定到的肽段按强度进行排序，选择强度最高的3条肽段以及对应的强度最高的6个子离子进行定量，其中带有可变修饰的肽段不选用。碰撞能量通过公式，二价离子CE=0.0339×母离子的m/Z+2.3597，三价离子CE=0.0295×母离子的m/Z+1.5123计算所得。所有离子对以及碰撞能量如表1所列。 表1目标蛋白的MRM离子对及碎裂能量 953.5 Positive 569.3 953.5 Precursor(m/z) Product (m/z) IAAEALLAPIR(+2) Positive IAAEALLAPIR(+2) IAAEALLAPIR(+2) IAAEALLAPIR(+2) IAAEALLAPIR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) FQSMPELSIDAAYSR(+2) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) LDIPAYASLDWVHQFNDR(+3) Positive 2目标蛋白的相对定量 采用TSQ Altis对表1中所列的MRM离子对进行分析，所得色谱图如图1所示。 在进行相对定量前，对G1样品重复进样4次以考察系统的稳定性，包括保留时间和定量峰面积的稳定性，结果如图2所示。 图2四次重复进样的系统稳定性， A： FadL蛋白的保留时间重复性；B：PA1767蛋白的保留时间重复性；C： FadL蛋白的定量峰面积重复性；D：PA1767蛋白的定量峰面积重复性 从图2A和2B中可知， 4次重复的保留时间CV值均小于0.7%，从图2C和2D中可知，4次重复的定量峰面积CV值均小于5%。然后我们对所有6个样品进行MRM定量并计算不同组之间的比值，与前期发现阶段用高分辨Orbitrap所得的差异变化方向一致，具体结果如表2所示。 表23组样品的MRM峰面积及组间比值 Compound Polarity Precursor (m/z) Product (m/z) S[+42.010565]DAAVDTSSETTKDLKEKKEVVEEAEN(+3】 S[+42.010565]I DAAVDTSSETTKDLKEKKEVVEEAEN(+3) Positive 998.8 1255.1 36 S[+42.010565] DAAVDTSSETTKDLKEKKEVVEEAEN(+3) Positive 998.8 316.1 36 S[+42.010565I DAAVDTSSETTKDLKEKKEVVEEAEN(+3) Positive 998.8 387.1 36 配制标准曲线时，将标准肽段逐级稀释(一共8个点，从5fg/pl到50pg/ul) 并加入一定量的BSA蛋白作为基质，代表性MRM图(目标肽段上样量1pg)如图3A所示。将8个标准曲线点的浓度和峰面积做图并进行线性拟合，如图4所示，结果可获得4个数量级的线性范围， LOQ达到柱上1.67amol(图3B)，线性方程y=9.3908x+420.98，R=1。 图4目标肽段的标准曲线 然后对2-6和2-7样品进行MRM定量，分别重复进样3次和4次，所得谱图如图3B和3C所示。并根据标准曲线计算两个样品中目标肽段的绝对浓度，以及多次重复的CV值，结果如表4所示。 表4样品中目标肽段的浓度测定结果 B 样品 浓度(fg/ul) 浓度平均值 浓度平均值 CV (fg/ul) (amol/ul) 2-6_1 98.64 2-6_2 104.18 99.98 33.39 3.72% 2-6_3 97.11 2-71 2-7 2 57.03 59.77 -56.68 18.93 4.34% 2-73 53.84 56.09 2-74 结论 C 结果表明，得益于增强型主动离子管控技术(AIM+)， TSQAltis三重四极杆适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白的分析，可以完成蛋白组学中的相对定量和绝对定量实验，全面提升了蛋白组学中的定量验证能力。此外，基于高分辨Orbitrap的蛋白质组学的发现型研究到基于TSQ Alits的蛋白质组学定量可以实现无缝对接，用于潜在生物标志物的发现、验证和确认。 D 图3 代表性标准品和实际样品中目标肽段的MRM图，A为代表 性标准品(目标肽段上样量1pg)， B为代表性标准品(目标肽段上样量1.67amol)， C为样品2-6， D为样品2-7 www.thermofisher.com ( 仅用于研究目的。不可用于 诊 断目的。◎ 2 018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留 所 有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除 非 另有指明 。 ) SCIENTIFIC 热线话 生物标志物的开发过程主要包括三个阶段，即发现、验证和确认。随着研究人员在发现阶段积累了大量数据之后，需要对发现阶段得到的差异表达蛋白进行验证和确认，从而推动生物标志物的开发，这就需要对目标蛋白进行定量实验。一般而言，定量实验包括相对定量和绝对定量两个水平，相对定量可以进一步验证差异蛋白的表达变化，绝对定量可以确认目标蛋白的绝对含量。这两种定量实验都需要在成分复杂的生物样品中完成，要求仪器必须具备高灵敏度高稳定性，以确保低丰度蛋白的检出和准确定量。TSQ Altis是赛默飞世尔科技在2017年ASMS推出的全新一代三重四极杆质谱仪，采用了增强型主动离子管控（Active Ion Management，AIM+）技术优化从离子源至检测器的离子传输、消除主要噪声源、精确隔离待测物，最终获得了极限定量性能。我们利用TSQ Altis 在复杂基质中针对目标蛋白和肽段分别进行相对定量和绝对定量的定量验证能力考察。其中，相对定量所得的定量结果与前期发现阶段用高分辨Orbitrap所得的差异变化方向一致；绝对定量实验中，目标肽段LOQ达到柱上1.67amol，并实现4个数量级的线性范围。得益于增强型主动离子管控技术（AIM+），TSQ Altis三重四极杆适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白的分析，可以完成蛋白组学中的相对定量和绝对定量实验，全面提升了蛋白组学中的定量验证能力。此外，基于高分辨Orbitrap的蛋白质组学的发现型研究到基于TSQ Alits的蛋白质组学定量可以实现无缝对接，用于潜在生物标志物的发现、验证和确认。