红茶、西兰花、牛油果和草莓中农药检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent食品检测与农业 Trusted Answers 强化食品安全检测 一种使用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 和 MassHunter 定量分析软件 10.0 LC/Q-TOF Screener 工具的农药筛查方法 Karen E. Yannell 和 Kai Chen 安捷伦科技有限公司 美国加利福尼亚州圣克拉拉市 本应用简报介绍了一种用于筛查各种复杂食品基质中数百种农药的方法。该筛查方法使使 Agilent 6546 四极杆行行时间液质联用系统以及 Agilent MassHunter 定量分析软件的 LC/Q-TOF Screener 工具。此工作流程解决方案能够可靠地执行目标物定量和疑似物筛查，具有优异的重现性、质量数准确度和线性。目标物定量与疑似物筛查工作流程的结合，降低了数据分析的复杂性，并减轻了数据审查的负担。 前言 农药检测实验室通常需要对样品中的大量分析物进行高可靠性的高通量分析。通常，使用三重四极杆质谱仪的靶向采集方法对目标分析物列表中的化合物进行定量分析，目标分析物列表的范围通常由地方政府计划决定，一般每年设置一次。定量分析通常需要使用各种分析物的分析级标准品进行日常校准。然而，政府计划导致需要监测的农药数量不断增加。因此，与标准品及其配制(通常在多种基质中)相关的成本有时会成为分析的限制因素。 实验室对经济有效的替代方法的需求日益增长，旨在高效扩展检测能力，不再局限于常规定量分析的目标化合物列表范围。某些化合物在样品中频繁出现，因此在初始筛查过程中进行定量分析是一种经济有效的做法，并有可能通过一次进样获得最终结果。安捷伦将这些化合物称为!“优先目标物”。然而，对于其他化合物，切实可行的做法是不建立校准曲线，而是在筛查后，根据最初在样品中检出的化合物进行定量分析。安捷伦将通过这种方式处理的化合物称为寸“疑似物”。对于这些化合物，这种疑似物筛查方法可以提高实验室的分析效率，因为常规校准的负担大大减轻。这取决于两方面： 首先，如果这些疑似物的含量为我们设定的含量或在此之上，那么所采用的方法能够可靠地检出它们 其次，在后续定量或确认步骤中，所采用的方法不会产生后来会被拒绝的不准确的结果。如果发生这种情况，将失去上文提到的分析效率优势 高分辨率四极杆飞行时间 (Q-TOF)质谱是三重四极杆系统的一种理想替代方案，因为 Q-TOF 平台能够测量分子离子和碎片离子的准确质量数和同位素模式，从而实现高度可靠的化合物鉴定。Q-TOF 系统还能够快速采集数据，在保持色谱峰具有足够多的数据点的情况下，采集分子离子和碎片离子的高质量数据。这对于那些适合同时定量分析的化合物而言非常重要，并且对于疑似物来说也很重要：如果生成的色谱峰更真实有代表性，则更容易鉴定疑似物。 近年来，随着技术的突破，Q-TOF系统的定量分析适用性随着灵敏度、选择性和动态范围的增强得到了显著提高。对于关注同时进行优先目标物定量分析和更广泛的农药疑似物筛查的实验室来说， Q-TOF正在成为一种“切合实际需求”的平台。简单易用的数据分析工作流程对于通过这种方式实现高通量、宽范围的Q-TOF 筛查非常重要。农药检测实验室非常希望筛查工作流程的软件工具能够将信息丰富的Q-TOF 数据高效转化为有意义的疑似物报告，以及包含定量结果的优先目标物报告。 关于后者，重要的是软件要报告地方政府任何相关指南(例如 SANTE/11813/2017)所要求的数据质量参数。此类工具还需要适应方法开发和验证的灵活性，因为实验室可能需要经常进行试验并查看哪些碎片离子是给定食品基质的最佳定性离子。 本应用简报介绍了6546 LC/Q-TOF MS和 Agilent MassHunter 定量分析软件LC/Q-TOF Screener， 从数据采集和数据审查的角度来看，这是一种能够同时实现优先目标物定量和疑似物筛查的简化的数据分析工作流程。利用安捷伦农药精确质量数谱库所提供的信息加快方法开发。 下面展示了主要研究证据。为确定常见农药的目标物定量分析范围，将多种农药加入四种代表性食品的提取物中进行基质匹配校准。根据 SANTE/11813/2017 指南的鉴定标准，将不太常见的农药视为疑似物。利用6546 LC/Q-TOF 经改善的低质量数分辨率(对于m/z 118，分辨率高于30000)、宽谱图动态范围(5个数量级)和优异的同位素保真度，可以获得高度可靠的结果和优异的定量线性。与硬件增强功能相结合，实验室现在可以使用基于 MassHunter 定量分析软件10.0的筛查工作流程，通过一次进样可靠地获得优先目标物定量和疑似物筛查结果。 实验部分 样品前处理、数据采集和分析方法设置使用 QuEChERS (EN) 方案对四种不同的食品基质(红茶、西兰花、牛油果和草莓)进行前处理。图1为草莓前处理方案示例。称取10g均质化的水果/蔬菜样品以及2g干红茶加入50 mL锥形管中，并使用 Agilent QuEChERS 萃取试剂盒(部件号5982-5650CH)按照 EN 15662缓冲盐方法进行萃取。在萃取前，用8mL超纯水将红茶样品润湿2小时。然后用相应的分散式 SPE 试剂盒净化粗提取物：利用 Bond Elut EMR-Lipid(部件号5982-1010)净化牛油果，利用用于分析高色素含量的水果和蔬菜的 dSPE 试剂盒(部件号5982-5356)净化红茶，利用用于分析含色素的水果和蔬菜的试剂盒(部件号5982-5256)净化西兰花，并利用用于一般水果和蔬菜的试剂盒(部件号5982-5056)净化草莓。对于其中某些基质，还处理了其他有机或常规食品样品。由安捷伦 LC/MS 农药全套测试混标产品(部件号5190-0551)制得农药混标。该农药混标包含250多种农药。其中，只有195种农药被视为优先目标物；由于混标中的某些分析物在正离子模式下不发生电离，因此主要分子离子的 MS/MS 谱图不在 PCDL中。将该混标稀释成5种不同浓度(100、200、400、1000和2000 ng/mL)的20倍储备液。然后在各种基质中将它们稀释20倍，制得浓度为5、10、20、50和100 ppb 的校准物。考虑到萃取过程中红茶的稀释倍数， 将这些校准储备液在基质中进一步稀释5倍。除校准物以外，还配制了12种不同化合物的单独储备液，并以10 ppb 和100 ppb 的浓度加入基质中，用作加标样品。在这些化合物中，8种化合物属于优先目标物，4种化合物为疑似物。随后利用疑似物 Screener 软件对所有这些化合 物进行单独评估。未知草莓样品购自美国特拉华州和加利福尼亚州的不同市场。对这16个样品进行处理并作为未知样品进行分析，以确定存在的农药并定量分析优先目标物。进样前，样品在硅烷化的HPLC样品瓶中于7℃下保存。 将 Agilent 1290 Infinity II Prime 液相色谱与6546 LC/Q-TOF 联用。表1显示了色 谱详细信息，表2列出了Q-TOF 参数。通过采集质谱图收集全离子 MS/MS数据，然后应用指定的一种或多种碰撞能量来采集谱图。这种非靶向采集分子离子和碎片离子数据的方法是 Q-TOF 采集所特有的优势功能，因为这意味着可以在不改变采集方法的情况下将更多化合物添加到数据分析中。这使食品实验室在分析数据时具有更高的灵活性，并且也是Q-TOF筛查相比于三重四极杆筛查的另一项关键优势。 在分析过程中，将嘌呤和HP-921(六(H，H，H-四氟丙氧基)膦嗪)用作参比离子。对系统进行初始校准后， Q-TOF 在进行数据采集的10天内无需维护或重新校准。工作列表包括基质空白，然后是校准样品和加标样品。如果处理了其他未知样品，则最后采集这些样品。对校准样品重复采集三次，同时对加标样品和未知样品重复进样两次。 在数据采集之后，将每个样品转换为SureMass 数据格式。 SureMass数据转换仅使用噪声统计和信号连续性在整个分析谱图集合中搜索特征，无需样品相关化学知识。 SureMass 格式的数据分析可加快处理速度，同时不影响质量数准确度。 MassHunter 采集软件10.0中支持的SureMass 转换在采集每个数据文件后自动进行。也可以在进行批量分析之前使用MassHunter 定量分析软件10.0进行数据转换。 在 MassHunter定量分析软件10.0中，可根据个人化合物数据库或谱库 (PCDL)轻松创建定量方法。通常，将母离子设置为定量离子，同时将具有指定碰撞能量 参数 1290 Infinityl液相色谱系统 分析柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3.0×150 mm，1.8pm (部件号959759-302) 保护柱 ZORBAX Eclipse Plus C18， 2.1 mm， 1.8 pm， UHPLC 保护柱(部件号821725-901) 柱温 45°C 进样量 2pL 自动进样器温度 进样针清洗 10秒，标准 (50：50 甲醇：异丙醇) 流动相A 水+4.5mmol/L甲酸铵+0.5mmol/L氟化+0.1%甲酸 流动相B 甲醇+4.5 mmol/L 甲酸铵 +0.5 mmol/L 氟化铵+0.1%甲酸 流速 0.45 mL/min 梯度 时间(min) %B0.00 20.50 21.00 504.00 6516.00 10018.00 10018.10 220.00 2 后运行时间 4 min 表2.6546 LC/Q-TOF 数据采集参数列表 参数 值 鞘气温度 400°C 鞘气气流 12 psi 气体温度 325°C 气流 10 psi 雾化器 20 psi 毛细管电压 4000V MS调谐 m/z750， 易碎裂离子 MS模式 正离子 采集 仅MS， 包含0、20和40 CE分段 MS 范围 m/z 50-1000 参比质量 121.0509(嘌呤的M+H*形式)922.0098 (HP-921 的M+H*形式) (CE)的选择性导入的碎片离子设置为定性离子。，一旦导入来自 PCDL 的化合物和碎片质量数，即可根据需要对分析物逐个进行各种自定义设置，包括校准浓度、质量数提取窗口、共流出得分等。经过优化 后，对于优先目标物的每种分子离子，该方法包括一种可重现的碎片离子(定性离子)，而对于疑似物，则包括四种碎片离子(定性离子)。 由于在该方法中没有可用的疑似物标准品，因此根据之前相同型号的色谱柱和LC所获得的结果来估算疑似物的保留时间(RT)。要根据 DG SANTE 指南的规定全面验证疑似物筛查，可能需要做更多的工作。图2显示了用于此全离子 MS/MS农药方法的分析方法设置完整详情。 利用MassHunter 定量分析软件10.0实 现目标物定量与疑似物筛查的结合MassHunter 定量分析软件10.0能够通过一种方法对一批样品进行优先目标物定量分析和疑似物筛查。该方法中的所有化合物都可以作为经典的定量批次在软件中 进行查看。用户可以浏览“化合物表”中的化合物或“批处理表”中的数据文件，在“化合物信息”窗格中查看色谱图和质谱图，并在“校准曲线”窗格中检查校准曲线。对于一批样品中的数百种化合物而言，这种分析和审查过程低效耗时。LC/Q-TOF Screener 工具根据鉴定的可信度对每个样品中的每种分析物进行绿色、橙色或红色标记，这样可以简化数据审查，因为可以按照颜色(标记)来筛选和审查分析物。在筛查工作流程中，过大的RT 漂移、低信噪比(S/N)、较差的共流出得分、同位素保真度或质量数准确度均视为异常值。 图2.来自PCDL 的分析方法开发工作流程以及MassHunter定量分析软件10.0中的异常值参数 带有绿色标记的化合物具有最高的可信度，因为其没有超出设定限值的异常值。带有橙色标记的化合物需要额外的审查，因为这些化合物虽然满足基本的鉴定标准，但是存在异常值。其中一个示例是，优先目标化合物的RT 与方法中规定的RT 相差大于0.2分钟的情况。带有红色标记的化合物未检出，因为它们不符合基本的鉴定标准。异常值可以进行调整，其在方法分析设置过程中在方法编辑器中进行设置(图2)。 Screener 可以结合传统的定量分析用户界面(UI)进行查看。这意味着对于 Screener发现的同时具有由批次生成的当前校准的化合物，审查人员可以立即看到浓度(以及生成的校准曲线等等)。将两个视图结合起来，便于快速导航(图3)。 Screener 还在中间窗格中显示平均全谱，在左下方窗格中显示仅包含方法中定义的离子的简化谱图，并在右下方窗格中显示同位素模式匹配结果(图3)以供用户检查数据质量。当标记为橙色时，这些视图非常有用，并且审查人员必须决定下一步操作。 LC/Q-TOF Screener 的开发初衷是为了让实验室能够开发基于 Q-TOF 的各种筛查方法，这些方法可根据 ISO 17025以及 DG Sante 制定的指南进行验证。这种结构在受控农药监测中非常常见，并且需要实验室来确定他们分析的化合物的范围(无论多大)，并表明某种形式的初始验证能够可靠地找出低至规定限值的各种化合物。 然而，实验室也可以以受控较少的方式有效地使用该工具，例如，在快速筛查尚未确认保留时间或碎片离子的疑似化合物时。在这种情况下，图3右下图中的同 位素模式匹配特别有助于确定鉴定的可信度。这类工作流程将不可避免地导致更高的假阳性率，并且不太适用于经验证的范围内的受控测试。但是，如果实验室有时间研究经验证化合物以外可能存在的化合物，则这些工作流程也有其用处。 图 3. LC/Q-TOF Screener 工具显示在传统的UI旁。在 Screener 结果中选择的化合物具有在分析中获得的校准曲线。该分析物将被视为优先目标物，并且可得到定量分析 农药筛查方法结果 在此方法中，优先目标物的浓度固定在5-100 ppb。表3汇总了在 5 ppb定量浓度下获得的定量性能。在浓度为 5 ppb的草莓、牛油果和西兰花基质样品的三次进样中，均检测到全部195种化合物。由于红茶基质样品经过进一步稀释，因此在该浓度下，仅检出145种化合物。所有检出的分析物的相对标准偏差 (RSD)均不超过20%，并且大多数化合物的R²为0.99或更高。图4显示了浓度为 5 ppb的示例分析物多效唑的定量分析结果。LC/Q-TOF Screener 旨在使195种优先目标物的审查更加高效，并且还可以在同一方法中对另外182种疑似化合物进行检测。因此，该分析总共包含377种农药。 表3.定量和疑似物筛查工作流程中的农药结果。浓度为5ppb 的红茶、草莓、牛油果和西兰花基质样品的结果(n=3) 草莓 牛油果 西兰花 红茶 目标化合物数量 195 195 195 145 在 5 ppb 下， S/N>3的目标物数量 195 195 195 145 在5 ppb 下， RSD<20%的目标物数量 195 195 195 145 R²>0.99 的目标物数量 195 194 195 145 筛查的化合物数量 182 182 182 182 除定量性能以外，还需要实现高可信度鉴定。借助全离子 MS/MS数据采集和SureMass 数据转换，可通过母离子和碎片离子的共流出、高质量数准确度和同位素保真度来实现这一目标。共流出得分显示在定性离子窗格中(图4)。此处较高的值(>70)意味着定性离子与定量离子很好地重叠。只有在同时检测到碎片离子和母离子时才会发生这种情况，它表明碎片离子由正确的母离子结构产生。 6546 LC/Q-TOF 在整个梯度范围内表现出 高质量数准确度，且与分析物浓度无关。图5显示了在分析物的给定 RT 下根据其质量数准确度绘制的样品色谱图。蓝色圆点表示10 ppb 样品的质量数准确度，黄色十字表示 100 ppb 样品的质量数准确度。几乎所有分析物的质量数误差都在±2ppm范围内(绿色线)。无化合物超出±5ppm的限值(橙色线)。 ×104 图4.(A)红茶、(B)西兰花、(C)牛油果和(D)草莓中浓度为 5 ppb的多效唑的定量离子信号、定性离子比和校准曲线 使用 LC/Q-TOF Screener 工具分析加标样品，其异常值设置与 SANTE 指南一致。表4中的加标分析物被视为优先目标物或疑似物。各种基质中两种不同浓度下的各种分析物结果报告为阳性(绿色)、待审查(橙色)和未检出(红色)。大多数分析物的检测结果呈阳性。当分析物被标记为“待审查”时，通常是由于信号较低，需要审查质量数匹配得分。这些分析物被标记为橙色，以促进审查过程，但是它们均符合SANTE 指南中的基本鉴定标准。 在未知的草莓样品中(n=16)，检测到的农药的浓度范围从小于5 ppb 到大于300 ppb。在常规样品中发现的分析物的数量多于在有机样品中发现的分析物，这一结果符合农药使用趋势。在本研究中，发现的大多数农药属于优先目标物。然而，在少数情况下，例如样品4和15，样品中包含不常见的分析物(疑似物)。在这些情况下，可能需要进行构象测试。 图5.草莓样品的总离子流色谱图(TIC)(A)，以及草莓基质中浓度为 10ppb (蓝色圆点)和100ppb (黄色十字)的优先目标物离子的质量数准确度相对于其 RT 所绘制的图(B) 表 4. 10 ppb 和100 ppb 加标样品的LC/Q-TOF Screener 结果 结果证明，将6546 LC/Q-TOF 与 MassHunter 定量分析软件10.0筛查工具相结合的一体化工作流程解决方案能够对各种复杂食品样品进行可靠的目标物定量和疑似物筛查。结果表现出了优异的重现性、质量数准确度和线性。将目标物定量和疑似物筛查集成到布局非常直观的同一软件中，大大降低了数据分析的复杂性以及数据审查的负担。 ( 参考文献 ) ( G uidance document on analyticaquality control and methodvalidation procedures for pesticidesresidues a nd analysis in food and feed，SANTE/11813/2017，21-22 November 2017. h t tps：//ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/pesticides_ m rl_guidelines_wrkdoc_2017-11813.pdf ) ( Miladi， M.； e t al.High-ThroughputPesticide Residue Analysis Usingan Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS and the MassHunter Productivity App (使用 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统和 MassHunter Productivity App 进行 高通量农药残留分析)，安捷伦科技公司应用简报，出版号 ) 5994-0196EN，2018 www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) 样品 类型 检出的农药 样品1 有机 马拉氧磷(2.6ppb)，甲萘威(29.4 ppb)， 马拉硫磷(31.8ppb)， 甲氧虫酰肼(雷通)(4.7 ppb)，二嗪农(敌匹硫磷)(2.5 ppb) 样品2 有机 多杀菌素 A(14.3ppb)， 多杀菌素D (3.6 ppb) 样品3 有机 未检出 样品4 有机 扑草净 样品5 有机 未检出 样品6 传统 粉唑醇(12.0ppb)， 甲霜灵(28.6 ppb)，嘧菌酯，嘧霉胺(218ppb)， 马拉硫磷(<5ppb)，环酰菌胺(5.6ppb)， 嘧菌环胺(26.6 ppb)， 肟菌酯(6.2ppb)， DEET (避蚊胺)(<5 ppb) 样品7 传统 噻虫嗪(<5 ppb)， 多菌灵(唑类)(163 ppb)，甲基托布津，氯虫苯甲酰胺 (5.6 ppb)，嘧霉胺(105 ppb)， 啶酰菌胺(23.5ppb)， 甲氧虫酰肼(雷通) (6.8ppb)， 腈菌唑(<5ppb)，联苯井酯(D 2341)， 氟醚唑(33.2 ppb)， 环酰菌胺，密菌环胺(248 ppb)， 唑菌胺酯(<5 ppb) 样品8 有机 啶酰菌胺(2.4ppb) 品9 传统 氟啶虫酰胺，马拉氧磷(<5ppb)， 粉唑醇(<5ppb)，嘧菌酯(<5 ppb)， 马拉硫磷(48.2ppb)，月菌唑(<5 ppb)， 喹氧灵(<5 ppb) 样品10 传统 啶虫脒(<5ppb)， 甲霜灵(<5ppb)，嘧菌酯(8.4ppb)， 腈菌唑，联苯肼酯(D2341)(<5 ppb)，环酰菌胺(32.4ppb)， 嘧菌环胺(283 ppb)，唑菌胺酯(10.8ppb)， 肟菌酯(46.9 ppb)，乙螨唑 样品11 传统 噻虫嗪(13.1 ppb)， 氟啶虫酰胺(97 ppb)， 多菌灵(唑类)，吡虫啉，嘧霉胺(278ppb)，甲氧虫酰肼(雷通)(14.8ppb)， 腈菌唑(<5ppb)，联苯酯(D2341)， 氟醚唑(12.3 ppb)，嘧菌环胺 (312ppb)， 亏菌酯(<5 ppb)， 噻螨酮(22.6ppb)，甲基托布津 样品12 传统 氟啶虫酰胺 (153 ppb)， 啶虫脒(<5 ppb)， 氯虫苯甲酰胺(69 ppb)， 甲氧虫酰肼(雷通)(<5ppb)，嘧菌环胺(146 ppb)， 肟菌酯(78ppb)， 喹氧灵 (34 ppb)， 噻螨酮(<5 ppb) 样品13 传统 氟啶虫酰胺(64ppb)，嘧菌酯，啶酰菌胺(14.7 ppb)， 嘧菌环胺(<5 ppb)， 唑菌胺酯(19.4 ppb)，环氟菌胺 样品14 传统 噻虫嗪(<5ppb)， 氟啶虫酰胺(29 ppb)，氯虫苯甲酰胺(<5 ppb)， 腈菌唑(<5 ppb)， 嘧菌环胺(64 ppb)， 肟菌酯(<5ppb) 样品15 传统 氟啶虫酰胺(77 ppb)， 马拉氧磷(<5 ppb)， 粉唑醇(8.1 ppb)， 嘧菌酯(<5ppb)， 马拉硫磷(47.5 ppb)， 腈菌唑(5.9 ppb)， 喹氧灵，环氟菌胺 样品16 传统 吡虫啉(48.4 ppb)， 甲霜灵(107 ppb)， 氯虫苯甲酰胺，嘧菌酯(457 ppb)， 啶酰菌胺(<5ppb)，月菌唑(<5ppb)， 氟醚唑(138 ppb)，喹氧灵(21.4 ppb)， 氟啶虫酰胺 (35.4 ppb) 本应用简报介绍了一种用于筛查各种复杂食品基质中数百种农药的方法。该筛查方法使用 Agilent 6546 四极杆飞行时间液质联用系统以及 Agilent MassHunter 定量分析软件的 LC/Q-TOF Screener 工具。此工作流程解决方案能够可靠地执行目标物定量和疑似物筛查，具有优异的重现性、质量数准确度和线性。目标物定量与疑似物筛查工作流程的结合，降低了数据分析的复杂性，并减轻了数据审查的负担。