植物中生理生态研究检测方案(植物荧光成像)

易 科 泰 生 态 技 术 有 限 公 司 Ecotech Ecological Technology Ltd. Plant Growth and Cultivation科研级植物培养系统方案 植物培养是生物实验室最重要的常规基础实验之一。以前的研究中，只要求培养系统能够使种子萌发、基本满足植物的生长即可。但在真正严格的植物生理生态研究中，传统培养箱由于种种原因是远远不能达到要求的。 本文将系统介绍一系列基于LED光源的科研级植物培养方案，包括SL3500植物培养LED光源、FytoScope植物生长箱等。这些培养方案和仪器是由欧洲植物生理科学家直接参与设计的，才能够真正进行精确的科研实验。 一、现代科研级植物培养的技术要求 1. 光源 众所周知，光是植物生长中最重要的环境因子之一，它不仅为植物光合作用提供辐射能，还为植物提供信号转导，调节其发育过程。植物在它的整个生命周期中始终处于一个不断变化的光环境中，在长期的进化中，植物不仅适应了光环境的变化，而且还能相互影响而改变周围的光环境。因此，培养箱光源就是决定其品质最重要的部分。 1）光质 到达地面的太阳光波长大约从300～2600nm，其中对光合作用的有效波长在400～700nm之间，其中425～490nm的蓝光以及610～700nm的红光对光合作用贡献率最大，而520～610nm(绿色)的光线被植物吸收的比率很低（闫新房，2009）。 LED(1ight—emitting diodes)，即发光二极管的一大特点就是可以发射出纯度极高的单色光（图1）。因此从LED诞生之初，红光和白光LED就被用于植物培养。 图1. FytoScope LED光源的单色光光谱 在很多研究中，科学家希望尽量模拟自然太阳光来培养植物。由图2中可以看到白炽灯和荧光灯虽然发出的都是白光，实际上其光谱都与太阳光谱有很大差异。与太阳光谱最为类似的就是卤光灯和白光LED。但是，卤光灯由于有相当一部分能量都用于发射植物不能利用的750-2600nm波段近红外辐射。美国GE公司的资料指出这部分能量占到总辐射能量的76%。同时，近红外辐射又会有极强的光辐射增温效应，长时间照射会对培养的植物造成损伤。而LED光源的一大优点就是发热量极少。这从图2的光谱图中也可以看到白光LED的近红外辐射是极低的。 图2.不同光源光谱图，上左：太阳光；上中：白炽灯；上右：荧光灯（日光灯）；下左：卤光灯；下中：冷白光LED；下右：暖白光LED 光除了给植物提供能量，还会直接通过光敏色素和隐花色素来调节植物的多种生理反应（图3）。光敏色素有两个互变异构体——红光光敏色素(Pr)和远红光光敏色素(Pfr)。Pr吸收波长为660 Bin左右的红光，Pfr吸收波长为730nm左右的远红光。光敏色素调节多种不同植物对光的反应，包括光周期，种子萌发、展叶、下胚轴伸长和脱黄化。隐花色素则吸收蓝光和紫外光范围的光波。 图3.光敏色素与激素的交互作用（Jaillais, 2010） 因此FytoScope在白光LED和红蓝LED以外，还配备了远红光光源。除了为植物生长提供最佳的光质，同时满足植物光形态建成的需要。另外，FytoScope可以提供绿光LED与红蓝LED组成三原色光源系统，通过调整三原色的比例，能够发出可见光谱中任意一种颜色的光，用于不同光质对植物影响的研究（图4）。 图4. 不同光源下拟南芥的成长状况及生理指标 2）光强 白炽灯、卤钨灯光效为12-24lm/W，荧光灯50-70lm/W，钠灯90-140lm/W，大部分的耗电变成热量损耗。而理论上LED发光源光效可达到300lm/W。 FytoScope LED光源植物培养箱可以在30-50cm的距离上实现最大2000µmol(photons)/m².s的光强，SL3500 LED光源甚至能达到3000µmol(photons)/m².s以上的光强，满足从藻类、拟南芥到小麦、玉米、水稻等高耐光植物的培养需求，并能够进行各种高光/低光胁迫实验。 3）光源与温湿度的调控 传统光源中，荧光灯不能调控光强，只能通过增加或减少灯管数量来粗略控制光强，并不能进行精确实验。白炽灯、卤钨灯虽然可以调节光强，但是由于光谱、光辐射升温等原因，并不是很适用于植物培养。 FytoScope可以分别精确控制每种单色光的光强、光照时间，并可以通过软件实现动态无级调控，模拟昼夜周期变化、日升日落等自然界中光环境变化，以及其他各种任意变化。同时温湿度也可以随着光强同步变化，模拟昼夜周期中气温的变化（图5）。 图5. FytoScope软件中编制的昼夜周期，并模拟日升日落 4）LED光源的其他优点 ①使用电源电压较低，供电电压仅为6-24 V，比使用高压电源更安全； ②节能高效，耗电量仅为白炽灯的八分之一，荧光灯的二分之一； ③可以在极短时间内发出脉冲光，响应时间快； ④体积小、结构紧凑、稳定性强； ⑤无污染，作为全固体发光体，不含金属汞、耐冲击、不易破碎、废弃物可回收，是一种绿色照明产品； ⑥寿命长，可达50 000小时以上，是普通照明灯具的几十倍。 2. 通风换气与培养气体成分控制 传统培养箱的通风换气是通过风扇来完成的，培养箱体积越大，需要的风扇就越大。这样会在培养箱内形成很强的气流，这对培养植物的生长反而造成了一定的干扰和胁迫。FytoScope使用了新式的层流式换气系统，确保培养箱中的气流速度不高于0.25 m/s，最大程度消除了换气气流对植物造成的影响。 传统培养箱只能给植物提供自然环境中的空气，气体成分变化很大，更不要说对成分进行控制。但对于很多研究温室效应或者其他气体对植物影响的科学家，他们需要精确控制培养植物的气体组分。FytoScope配备了GMS150高精度气体混合系统，可控制最多4种生长箱中的气体浓度。标配版可控制空气/氮气和CO2，也可以根据用户需要配置其他气体的控制功能。系统中内置高精度质量流量计，调控精度高于±2%，稳定性高于±0.1%。在研究温室效应时，可以将CO2浓度精确控制到ppm级。 图6. 左：配备GMS150的FMT150藻类培养与在线监测系统；右：配备GMS150的FytoScopeLED光源生长箱 3. 植物生理与表型监测 传统培养箱只能对植物进行一般性培养，并不能在培养过程中自动获得植物生长相关的生理生态监测数据，还需要研究人员将植物取出手动测量。不但耗费人力，而且还会对植物的培养过程造成干扰。 FytoScope配备了MP100叶绿素荧光自动监测仪。MP100内置有目前国际上荧光研究的几乎所用测量程序，包括Ft、QY、OJIP、NPQ、光响应曲线。可以用于光合活性研究、自然环境条件下植物光合能力的长期监测、植物胁迫检测、除草剂测试、人工或野外条件下的植物生长情况监测等。 研究者可以通过FytoScope设计不同的昼夜周期、光质/光强变化、高温/低温胁迫、气体组分等实验，再通过MP100实时监测植物荧光生理指标，进而完成一个完整的植物生理实验。这使得FytoScope单独完成一个实验过程，成为真正的科研仪器，而不同于传统培养箱仅仅是培养实验材料的工具。 对于大型生长室来说，还可以与PlantScreen高通量植物表型分析系统联合工作。PlantScreen高通量植物表型分析系统是最新的植物表型与作物育种研究技术的集大成者。它整合了LED植物智能培养、自动化控制系统、RGB 真彩 3D 成像、叶绿素荧光成像测量分析、植物热成像分析、植物近红外成像分析、植物高光谱分析、自动条码识别管理、自动称重与浇灌系统等多项先进技术，以最优化的方式实现大批量植物样品——从模式植物拟南芥到大型农作物如小麦、玉米到的全方位生理生态与形态结构成像分析，可以对植物表型组进行全面、自动、高通量且无人值守的长期研究分析，可以获取和研究植物整个生活史的生理变化和表型分析的所有相关海量数据。在国际上已经装备到许多科研院所和孟山都等多家跨国种业公司，是目前国际上应用最广、技术最全面的高通量植物表型分析系统。 图7. PlantScreen高通量植物表型分析系统 二、植物培养系统方案 1. 光源 SL3500 智能LED光源： 适用于培养单株或多株小型植株、藻类，配备支架，可单独工作 最大光强可达3000µmol(photons)/m².s，均一性光照，精确调控 可定制单色、双色或三色光源，光谱从UVA到远红光可选 Fyto-Panels智能LED光源 适用于培养架、培养室进行大量培养 在100cm距离上光强达280-1500µmol(photons)/m².s，均一性光照，精确调控 标配冷白+远红LED，其他光源可定制 2. FytoScope植物生长箱 FytoScope配备有多种尺寸型号，满足不同用户的需求。其内部容积如下： FS 130：124L FS 360：290L Reach-In FytoScope：900L Step-In FytoScope：3400L/4400L Walk-In FytoScope：超大型版，尺寸可定制，可与PlantScreen植物表型成像分析系统组合成为更先进的研究分析系统。 图8. 上左：FS 130；上右：FS 360；中左：Reach-In FytoScope；中右；Step-In FytoScope；下：与PlantScreen植物表型成像分析系统组成联合系统的Walk-In FytoScope 技术特点： 全LED光源，标配冷白+远红LED，其他光源可定制 30-50cm的距离上最大光强可达2000µmol(photons)/m².s 光照、温度、湿度可分别同步自动调控 层流式通风系统，最大程度消除了换气气流对植物造成的影响 可添加摇床进行藻类培养 配备叶绿素荧光监测模块，可实时监测植物光合生理和生长状况 配备GMS150高精度气体混合系统，精确调控气体组分，可进行温室效应等研究 配备专用软件，用户自定义编程控制并实时记录环境数据，可实现无人值守长期培养 3. 大型生长室 根据客户实际情况量身定制 在线控制与实时环境监测 自动光照、温湿度、CO2调控 可设置多个温室分区进行分别环境调控 可结合PlantScreen高通量植物表型成像分析系统进行表型组学、遗传育种等科学研究 图9. 德国莱布尼茨植物遗传与栽培作物研究所（IPK）的超大型生长室结合两套PlantScreen高通量植物表型成像系统 4. AlgaeTron藻类生长室 内部容积：124 L、265L 全LED光源，标配冷白+远红LED，其他光源可定制 集成专用定轨摇床 最大光强可达1500µmol(photons)/m².s 光照、温度、湿度可分别同步自动调控 配备GMS150高精度气体混合系统，精确调控气体组分，可进行温室效应等研究 配备专用软件，用户自定义编程控制并实时记录环境数据，可实现无人值守长期培养 5. 其他培养方案 Cultivation Bank LED 培养台 适用于在大型生长室内同时模拟多种光照、温度环境，进行植物培养对照实验；也可作为生长箱单独使用 全LED光源，白光+远红光，白光+远红光+红光，红光+绿光+蓝光+远红光三选一，其他光源可定制 配备叶绿素荧光监测模块，可实时监测植物光合生理和生长状况 智能LED培养架 用户定制开放式培养系统 全LED光源，标配冷白+远红LED，其他光源可定制 配备叶绿素荧光监测模块，可实时监测植物光合生理和生长状况 配备专用软件，用户自定义编程控制并实时记录环境数据，可实现无人值守长期培养 三、发表文献及应用案例 1. 拟南芥叶片和植株年龄对光合能力的影响Bielczynski L W, et. al, 2017, Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology, DOI: https://doi.org/10.1104/pp.17.00904 Bielczynski为了研究拟南芥叶片和植株年龄对光合能力的影响，使用FytoScope生长箱模拟了长期高光适应培养过程，最高光强1800µmol(photons)/m².s。同时使用FluorCam叶绿素荧光成像系统进行不同生长阶段拟南芥植物与叶片的叶绿素荧光成像测量（图10），从而发现在拟南芥生长过程中，稳态的光合能力在逐渐上升。在高光胁迫下，老叶的适应能力要低于幼叶。 图10. 不同叶片与同一叶片不同年龄的叶绿素荧光成像 2. 拟南芥基因型和表型监测Pavicic M, et. al, 2017, Genomic and Phenomic Screens for Flower Related RING Type Ubiquitin E3 Ligases in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science, doi: 10.3389/fpls.2017.00416 花期调控是结合内生信号和环境信号来促进花的发育。因此在研究相关基因表达过程中，需要对环境条件进行严格控制，在结合Phenotyping表型成像进行相关分析。芬兰赫尔辛基大学的Pavicic在研究拟南芥泛素E3链接酶时就是通过FytoScope生长箱调控严格的昼夜节律培养过程，同时结合PlantScreen高通量表型成像分析系统（图11，图12）对拟南芥的莲座发育表型进行分析。为这一研究，他们通过这两套系统开发出专门的实验流程，可以在一个实验周期里，对近1000株拟南芥进行发育、形态和开花的高通量表型监测。 图11. 芬兰赫尔辛基大学PlantScreen植物表型成像分析系统自动传送版 + FytoScope Walk-in大型生长室 图12. 拟南芥莲座形态参数与生长动态 3. ABA诱导拟南芥气孔关闭的调控通道Eisenach C, et. al, 2017, ABA-Induced Stomatal Closure Involves ALMT4, a Phosphorylation Dependent Vacuolar Anion Channel of Arabidopsis. Plant Cell, doi:10.1105/tpc.17.00452 气孔的开闭与光照、温度、湿度等环境因素密切相关，因此在其相关基因与调控的研究中，必须对这些环境因素进行精确控制。在本研究中正是使用了FytoScope生长箱精确模拟了光暗交替的培养周期，从而测量不同光暗条件下气孔对ABA的反应（图13）。 图13. 光暗条件下气孔对ABA的反应 4. 海岸带植物对气候变化的响应机制 Duarte使用FytoScope模拟昼夜变化研究了C3植物Halimione portulacoides 和C4植物海岸米草Spartina maritima在不同溶解CO2条件下的生理变化，探讨盐沼植物对气候变化的响应。一方面FytoScope可以调控温度、光照及昼夜变化；另一方面FytoScope也能够精确控制CO2浓度（Duarte，2014）。 图14. 不同CO2和光照条件下两种植物氧气的生产和消耗 Duarte使用溶解氧测量仪（RF-O2荧光光纤氧气测量技术）测量两种植物在不同CO2和光照条件下的放氧速率（图8）；同时通过FytoScope中的MP100叶绿素荧光监测仪来测量OJIP曲线、Fv、QY、ABS/CS、TR0/CS、ET0/CS等十余项荧光参数来分析对光合系统的影响（图15）。 图15.两种植物在不同CO2条件下的OJIP动力学曲线 最后，Duarte认为盐沼会通过水体的氧化作用与吸收过量CO2的酸化缓冲作用，在气候变化的补偿效应中扮演重要的角色。 5. 重金属胁迫对种子发芽与光合生理的影响 Santos使用FytoScope来研究Zn在灯心草属模式种Juncus acutus中的超积累（Santos，2014）。通过设置一系列不同浓度的Zn胁迫梯度来培养J. acutus，测量发芽率、干重等生长指标（图16）。又用FP100叶绿素荧光测量仪来分析Zn对其光合系统的损伤（图17）。 图16. J. acutus在不同浓度Zn中的发芽情况 图17. J. acutus在不同浓度Zn中的OJIP动力学曲线 Santos最终的结论是表现出了J. acutus对高浓度Zn的高耐受性，同时能够抵御Zn对叶绿体膜造成的过量氧化物积累的伤害。因此，J. acutus可以用于对陆地和水体的重金属污染生态修复。 6.高光胁迫对藻类的影响 Domingues研究了硅藻Phaeodactylum tricornutum对高光照造成的光氧化胁迫的响应机制（Domingues，2012）。发现将低光适应（40µmol(photons)/m².s）后的硅藻进行高光（1250µmol(photons)/m².s）照射，会产生非光化学淬灭（NPQ）的快速响应（图18）。而且高光照对最大量子产额（Fv/Fm）造成了和林可霉素相同的效果，即活性PSII反应中心的显著减少。 图18. P. tricornutum NPQ和Fv/Fm的变化 Domingues认为P. tricornutum在高光下会将总蛋白更多的分配给光抑制靶蛋白D1，并激活D1修复循环来限制光抑制。 参考文献： 闫新房等，2009，LED光源在植物组织培养中的应用，中国农学通报，12：42-45 Jaillais Y, et. al, 2010, Unraveling the paradoxes of plant hormone signaling integration, Nature Structural & Molecular Biology, 17:642–645 Bielczynski L W, et. al, 2017, Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology, DOI: https://doi.org/10.1104/pp.17.00904 Pavicic M, et. al, 2017, Genomic and Phenomic Screens for Flower Related RING Type Ubiquitin E3 Ligases in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science, doi: 10.3389/fpls.2017.00416 Eisenach C, et. al, 2017, ABA-Induced Stomatal Closure Involves ALMT4, a Phosphorylation Dependent Vacuolar Anion Channel of Arabidopsis. Plant Cell, doi:10.1105/tpc.17.00452 Duarte B, et. al, 2014, Light–dark O2 dynamics in submerged leaves of C3 and C4 halophytes under increased dissolved CO2: clues for saltmarsh response to climate change, AoB PLANTS, doi: 10.1093/aobpla/plu067 Santos D, et. al, 2014, Unveiling Zn hyperaccumulation in Juncus acutus: Implications on the electronic energy fluxes and on oxidative stress with emphasis on non-functional Zn-chlorophylls, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 140:228-239 Domingues N, et. al, 2012, Response of the diatom Phaeodactylum tricornutum to photooxidative stress resulting from high light exposure, PLoS one, 7(6): e38162 北京市海淀区高里掌路3号院6号楼1单元101B Tel.: +86 10 82611269/1572 Fax: +86 10 62536325 Http://www.eco-tech.com.cn Email:sales@eco-tech.com.cn info@eco-tech.com.cn SL3500 智能LED光源：适用于培养单株或多株小型植株、藻类，配备支架，可单独工作最大光强可达3000µmol(photons)/m².s，均一性光照，精确调控  可定制单色、双色或三色光源，光谱从UVA到远红光可选FytoScope植物生长箱：FytoScope配备有多种尺寸型号，满足不同用户的需求。其内部容积如下：§ FS 130：124L§ FS 360：290L§ Reach-In FytoScope：900L§ Step-In FytoScope：3400L/4400L§ Walk-In FytoScope：超大型版，尺寸可定制，可与PlantScreen植物表型成像分析系统组合成为更先进的研究分析系统。