ADC与mAb中变性及非变性条件下分子量检测方案(气相色谱仪)

thermoscientific 使用 Q Exactive 系列高分辨质谱对ADC 与 mAb 进行变性及非变性条件下分子量测定 张晓夕1，林军 关键词： QExactive Plus Biopharma； ADCs； NativeMS； SEC 一、前言 随着生物制药工业的发展，通过将单克隆抗体本身的二硫键打开，由此在半胱氨酸的自由巯基上偶联小分子药物的 ADC 越来越多。由于此类 ADC 分子链间的二硫键被打开，其轻/重链之间仅靠非共价键结合，在传统的变性质谱条件下会解离成抗体片段，无法测定完整蛋白的分子量。非变性质谱(Native MS)是一种近年来得到不断发展和推广的新兴分析技术，，可以在保持蛋白非共价作用力条件下进行分子量测定，采用非变性质谱进行 cysteine-linkedADC 分析显示了强大的应用潜力。 Thermo ScientificTM Q ExactiveM Plus Biopharma 平台质谱仪保持了 Orbitrap 超高分辨质谱平台的固有优点，如高分辨率、高质量精度和高灵敏度兼具，在此基础上又对其mass range 做了进一步扩展，新增的 High Mass RangeMode ( HMR Mode) m/z 上限可至8000 Da， 同时又针对高质量端离子传输进行了优化，进一步提高了高质量端离子的传输效率，并改进了 HCD 的压力调节。该平台包括三种不同分析模式(Standard Mode、Protein Mode 及HMR mode)，可覆盖生物制药领域的表征全流程。 二、实验条件 2.1样品条件 本次实验共分析了两个样品，ly一个为 Cysteine 偶联小分子药物的 ADC， 另一个为相对应的裸抗，两个样品均溶于产品特定的缓冲液体系中。上样至变性质谱体系分析的样 品使用10k 超滤管将溶液体系置换为 0.1% FA， H，O体系，浓度1 pg/uL；上样至非变性质谱体系分析的样品使用双蒸水将样品分别稀释至1ug/uL(ADC) 和 4.4 pg/uL(mAb)后备用。 2.2 变性质谱条件 变性条件下分子量的测定在QExactive HF平台上进行，相关实验条件如下： 液相： Thermo Ultimate 3000 RSLC 色谱柱： PLRP-S， 5 um， 1000A，2.1x50mm 流动相：B相(0.1%FA， HO)； C相(0.1%FA， ACN) 梯度：如表1 流速：300 pL/min 上样量：1 pg Time/min C0% 0 5 1 5 5 90 7 90 9 5 10 5 质谱参数设置如下表： 表2.变性条件下分子量测定-质谱参数 ADC mAb Mass Range (m/z ) 700-4000 2000-4000 Resolution 30，000 15，000 In-Source CID (eV ) 50.0 50.0 Microscans 10 10 AGC target 3e6 3e6 Maximum IT(ms) 200 200 2.3非变性质谱条件 非变性条件下分子量的测定在Q Exactive Plus Biopharma平台上进行，相关实验条件如下： 液相： Thermo Ultimate 3000 RSLC 色谱柱： Thermo MAbPacTM SEC-1， 5 um， 300A，4x300mm 流动相：50mM醋酸铵溶液 流速： 300uL/min 上样量： ADC 15pL， mAb 10 pL 质谱： QExactive Plus Biopharma 分析模式： HMR MODE； Resolution：依次使用17500/35000两档分辨率，分别对两个样品进行了分析 Scan Range： 2500~8000(m/z) Micro Scan：10； SID： 100 eV； S-lens： 200 2.4数据处理 所有原始数据的处理均在 Biopharma Finder 1.0 SP1 软件平台上进行。 三、实验结果 3.1变性质谱实验结果 图1.变性条件下 mAb 样品原始谱图 上图为变性条件下 mAb样品分子量测定结果。由图中可以看出，原始谱图基线干净，信噪比高，各个主要糖型之间均实现了基线分离。对该数据进行去卷积处理(图2)，可见主要糖型均得到精确解析(表3)。 Average Mass Delta Mass Matched Delta Relative Abundance Fractional Abundance (Da) (Da) Mass (ppm) Matched Sequence (%) (%) 147991.31 0.00 7.7 2xA2G0F；2xLys loss 100.0000 36.5779 148154.17 162.86 2.8 1xA2G0F，1xA2G1F；2xLys loss 72.5227 26.5273 148315.88 324.56 5.8 1xA2G0F，1xA2G2F；2xLys loss 47.5453 17.3911 148477.34 486.03 10.3 1xA2G1F，1xA2G2F；2xLys loss 17.5277 6.4112 148122.00 130.69 9.3 2xA2G0F；1xLys loss 5.0458 1.8456 148768.98 777.67 7.7 1xA2G1F，1xA2S1G1F；2xLys loss 3.1462 1.1508 148643.84 652.53 19.0 2xA2G2F；2xLys loss 2.4615 0.9004 147541.25 -450.06 12.1 1xM5，1xA1G0；1xLys loss 1.8083 0.6614 147770.34 -220.97 6.4 1xA2G0F，1xA1G0；1xLys loss 1.7701 0.6475 149056.00 1064.69 16.6 1xM5，1xA4S1G2 1.5380 0.5626 图 3.变性条件下 Cys 偶联ADC 分子量测定结果 上图为变性条件下 ADC 样品原始谱图，在此实验条件下ADC 内部的非共价结合被破坏，主要以1/2 ADC 的形式存在，其质谱峰主要分布在 m/z=1000~2600的范围内；另外，在 m/z=2600~3600 范围内还有少量共价结合的intact ADC 分布。 图4.变性条件下 Cys 偶联 ADC 去卷积后结果 对图3中的原始数据进行去卷积处理，结果如图4所示。 由于该药物为 Cys 偶联的ADC， 所以在变性条件下可以发现大部分都以 1/2ADC 的形式存在。 图5图4中主峰附近局部放大图 观察主峰附近，可发现含量最高的组分(MW=76795.06)为 GOF+2 drugs， G1F+2 drugs， G2F+2 drugs 也可以清 下表中列出了在变性条件下对 Cys 偶联的 ADC 进行分子量测定含量排名前十的组分解析结果。 表4.变性条件下测定 Cys 偶联 ADC 组分列表 ( Top 10) Average Delta Relative Fractional Intensity Abundance (%) Abundance (%) Remark Mass Mass(Da) 76795.06 47953788 0.00 100.0000 24.6075 GOF+2drugs 76955.98 18941658 160.92 39.4998 9.7199 G1F+2drugs 76747.82 16500266 -47.24 34.4087 8.4671 76848.35 5166368 53.29 10.7736 2.6511 74904.36 4922857 -1890.70 10.2658 2.5262 76670.55 3368071 -124.51 7.0236 1.7283 77120.35 3098310 325.29 6.4610 1.5899 G2F+2drugs 74686.87 3073333 -2108.20 6.4089 1.5771 73400.74 2802953 -3394.32 5.8451 1.4383 75344.38 2705693 -1450.69 5.6423 1.3884 3.2非变性质谱实验结果 在QExactive Plus Biopharma 平台上对 mAb 和 ADC 样品分别进行非变性质谱条件下的分子量测定，实验结果如下： 图6A非变性质谱条件下测定 ADC 分子量原始原图(R=17500) 在17500分辨率下测定 ADC 样品分子量(图6A)，发现仍有少量 1/2 ADC 形式存在的样品 (m/z=2500~5000)，但主要以 intact ADC 的形式存在(m/z=5000~7000)，说明在该离子化条件下，虽然仍存在较小部分的非共价键破坏，但 ADC 大部分还是以非共价键连接的完整形式存在。 图6C图6A局部放大(R=17500， m/z=2500~5000) 将1/2 ADC (m/z=2500~5000)部分放大观察(图6C)，同样可见偶联了不同药物与不同糖型的簇峰分布。 332378R1339-1070A67 N54E3 图 6C 图6A局部放大(R=17500， m/z=2500~5000) 将 1/2 ADC (m/z=2500~5000)部分放大观察(图6C)，同样可见偶联了不同药物与不同糖型的簇峰分布。 图 7AADC 样品解卷积结果(R=17500， m/z=5000~7000) 图7A为17500分辨率下，对原始数据 m/z=5000~7000范围内解卷积得到的结果，可见 ADC 样品主要以偶联了4个小分子药物的形式存在，也有偶联了3个小分子药物的峰被检测到。偶联了4个小分子药物的 ADC 理论分子量应为145380Da左右，由图7A中不难发现则测值与理论分子量有较大误差，因为非变性状态下，样品可能与溶剂等有粘附效应，17500分辨率下不足以将样品与干扰峰分离开，造成质量偏差。 对 1/2 ADC 样品进行去卷积处理，得到结果如图7B所示，主要是偶联了两个小分子药物的 GOF/G1F/G2F 三种不同糖型。 图8A非变性质谱条件下测定 ADC 分子量原始谱图(R=35000) 在35000分辨率下测定 ADC 样品分子量，发现仍有少量1/2 ADC 形式存在的样品(m/z=2500~5000)，但主要以intact ADC 的形式存在(m/z=5000~7000)。 图8B图8A局部放大(R=35000， m/z=5000~7000) 将 intact ADC (m/z=5000~7000)部分放大观察(图8B)，可见偶联了不同药物与不同糖型的簇峰分布。 图 8C 图8A局部放大(R=35000， m/z=2500~5000) 将 1/2 ADC (m/z=2500~5000)部分放大观察(图8C)，同样可见偶联了不同药物与不同糖型的簇峰分布。 图 9AADC 样品解卷积结果(R=35000， m/z=5000~7000) 观察图9A中解卷积结果，可见与R=17500 时相比，使用35000分辨率分析样品，由于分辨率的提高，可以更好排除干扰，测得分子量也更精确。样品中主要以结合了4个小分子药物的形式存在，也有部分结合了3个小分子药物的峰被观察到。 图9B ADC 样品解卷积结果(R=35000， m/z=2500~5000) 对 1/2 ADC 样品进行去卷积处理，得到结果如下，主要是偶联了两个药物的 GOF/G1F/G2F三种不同糖型。 为何在不同分辨率时测定的分子量会有差异?从图10中可以看出，当使用较低分辨率(R=17500)时，无法将样品峰与杂质峰(如溶剂加合峰等)分开，造成测量结果有较大偏差；随着分辨率的提高，样品中的各个组分被精确分离，测得分子量的精确度也随之提高。 图11非变性条件下 mAb 样品原始谱图(R=17500) 使用17500分辨率在非变性条件下对 mAb 样品进行分析，可得到糖型均实现基线分离的高信噪比原始谱图，主要分布在m/z=5000~7000 的范围内。 图12非变性条件下 mAb 样品去卷积后结果(R=17500) 表5非变性条件下mAb 样品组成(R=17500) Average Mass Intensity Delta Mass Matched DeltaMass (ppm) Matchedsequence 147994.55 4042224.25 0.00 14.2 mAb；2xLysloss；2xA2G0F 148157.41 2733454.75 162.86 19.0 mAb；2xLys loss；1xA2G0F，1xA2G1F 148320.00 1653998.00 325.45 22.1 mAb；2xLysloss；2xA2G1F 148483.36 573667.50 488.81 30.2 mAb；2xLys loss；1xA2G1F，1xA2G2F 148642.02 104704.75 647.47 6.8 mAb；2xLysloss；2xA2G2F 使用17500分辨率分析mAb 样品，发现实测分子量与理论分子量有较大偏差，推测是由于 native 状态下溶剂聚合效应等较严重，低分辨率下不足以将样品峰与杂质峰分离开。 图13非变性条件下 mAb 样品原始谱图(R=35000) 使用35000分辨率对 mAb 样品进行分析，如图13所示，主要分布在 m/z=5000~7000 的范围内。 图14非变性条件下mAb 样品去卷积后结果(R=35000) 使用35000分辨率分析 mAb 样品，可见实测分子量与理论分子量偏差大大减小，说明由于分辨率的提高，可以将样品峰与杂质峰分离开。 表6非变性条件下 mAb 样品组成(R=35000) Average Mass Intensity Delta Mass Matched DeltaMass (ppm) MatchedSequence 147991.48 369975.78 0.00 6.5 mAb；2xLyslocs；2xA2GOF 148153.30 232106.17 161.81 8.7 mAb；2xLys loss；1xA2G0F，1xA2G1F 148315.98 164404.39 324.50 5.0 mAb；2xLloss；2xA2G1F 148478.06 64033.40 486.58 5.4 mAb；2xLys loss；1xA2G1F，1xA2G2F 从上表中不难发现，当使用35000 的分辨率时，对于含量最高的前四个糖型，其实测分子量与理论分子量的偏差均在 10 ppm 之内。 四、讨论 在本实验中，我们在Q Exactive 系列高分辨质谱平台上，分别采用变性质谱条件和非变性质谱条件，对Cys 偶联的ADC 和与之对应的 mAb 样品进行了分子量测定。在变性质谱平台上， mAb 的分子量可以得到精确解析， ADC 样品由于其非共价结合被破坏，被检测到的主要是 1/2ADC形式，，可观察到其典型的糖型与小分子药物偶联分布。 在非变性质谱实验中，将体积排阻色谱与 Q Exactive PlusBiopharma 高分辨质谱平台联用，使用其专为完整蛋白分析所设置的 HMR (High Mass Range) 模式对 ADC 及mAb 样品进行分子量测定，可在保持 ADC 非共价结合的状态下测定其分子量与糖型、偶联不同药物的分布；实验中使用了 17500/35000 两档分辨率，发现随着分辨率的提高，可以将样品峰与杂质峰分离开，从而更准确的测定样品分子量。 通过本实验不难得知，基于 Orbitrap 技术的 Q ExactivePlus Biopharma 质谱平台，在完成常规肽图分析、变性质谱条件下测定蛋白分子量的同时，还可以与体积排阻色谱串联，方便快捷的测定非变性条件下 ADC 样品，尤其是Cys 偶联样品的分子量。 SCIENTIFIC 支持手机用户)A Thermo Fisher Scientific Brand     随着生物制药工业的发展，通过将单克隆抗体本身的二硫键打开，由此在半胱氨酸的自由巯基上偶联小分子药物的 ADC 越来越多。由于此类 ADC 分子链间的二硫键被打开，其轻/重链之间仅靠非共价键结合，在传统的变性质谱条件下会解离成抗体片段，无法测定完整蛋白的分子量。非变性质谱（Native MS）是一种近年来得到不断发展和推广的新兴分析技术，可以在保持蛋白非共价作用力条件下进行分子量测定，采用非变性质谱进行 cysteine-linked ADC 分析显示了强大的应用潜力。    Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus Biopharma 平台质谱仪保持了 Orbitrap 超高分辨质谱平台的固有优点，如高分辨率、高质量精度和高灵敏度兼具，在此基础上又对其 mass range 做了进一步扩展，新增的 High Mass Range Mode（HMR Mode）m/z 上限可至 8000 Da，同时又针对高质量端离子传输进行了优化，进一步提高了高质量端离子的传输效率，并改进了 HCD 的压力调节。该平台包括三种不同分析模式（Standard Mode、Protein Mode 及 HMR mode），可覆盖生物制药领域的表征全流程。    在本实验中，我们在 Q Exactive 系列高分辨质谱平台上，分别采用变性质谱条件和非变性质谱条件，对 Cys 偶联的 ADC 和与之对应的 mAb 样品进行了分子量测定。在变性质谱平台上，mAb 的分子量可以得到精确解析，ADC 样品由于其非共价结合被破坏，被检测到的主要是 1/2ADC 形式，可观察到其典型的糖型与小分子药物偶联分布。    在非变性质谱实验中，将体积排阻色谱与 Q Exactive Plus Biopharma 高分辨质谱平台联用，使用其专为完整蛋白分析所设置的 HMR（High Mass Range）模式对 ADC 及 mAb 样品进行分子量测定，可在保持 ADC 非共价结合的状态下测定其分子量与糖型、偶联不同药物的分布；实验中使用了 17500/35000 两档分辨率，发现随着分辨率的提高，可以将样品峰与杂质峰分离开，从而更准确的测定样品分子量。    通过本实验不难得知，基于 Orbitrap 技术的 Q Exactive Plus Biopharma 质谱平台，在完成常规肽图分析、变性质谱条件下测定蛋白分子量的同时，还可以与体积排阻色谱串联，方便快捷的测定非变性条件下 ADC 样品，尤其是 Cys 偶联样品的分子量。