环境水体中痕量百菌清检测方案(液相色谱仪)

样品前处理2 3Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 余彦海钟新林金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：甲萘威；百菌清；在线固相萃取；双梯度高效液夜色谱； Key words： Carbaryl； Chlorothalonil； On_line SPE； Dual_gradient HPLC； 引言 甲萘威( Carbaryl) 是一种氨基甲酸酯农药，由于杀虫谱广和毒性较低，在农业上应用颇广。研究表明其有一定的蓄积作用，对皮肤粘膜有损害。对斑马鱼的研究表明，甲萘威可导致心脏毒性。百菌清(Chlorothalonil) 是广谱性保护性杀菌剂，对多种真菌病害具有预防作用，药效稳定，残效期长。文献报道百菌清在一定剂量下对动物的肝、肾、肺等重要脏器有影响；有致敏、致突变作用。 近年来甲萘威和百菌清在农业上的大量使用，也导致环境水体中甲萘威和百菌清残留的风险增加，这也可能危害环境和导致人身风险。因此，国家标准GB/T 5479-2006规定饮用水中百菌清的含量不得高于0.01mg/L，对甲萘威没有限值规定；美国环境保护局《饮用水标准》2006版健康指南中建议儿童每天饮用一升水中甲中威不得高于1pg/L，百菌清不得高于0.2pg/L；成人每天每千克甲萘威不得高于0.01 mg， 百菌清不得高于0.015mg，并且认为百菌清具有潜在致癌的作用。 对于水体中甲萘威和百菌清的检测方法，文献报道有气相色谱法2、液相色谱法135等等，但由于常规检测器达不到痕量检测低检测限要求，一般要采用大体积液液萃取4、离线固相萃取等样品前处理方法，对于液相色谱方法，还需要采用柱后衍生才能达到需要的检测限。这些方法不仅增加了操作复杂程度，降低了方法的准确度和精密度，也增加了操作人员暴露在有机试剂中的几率，增加劳动保护的难度。 为解决上述难题，本文建立了常规紫外检测器下同时测定水体中痕量甲萘威和百菌清的在线固相萃取-高效液相色谱方法。本方法的原理如图2，首先通过自动进样器将大体积样品直接注入到在线固相萃取柱上，利用双梯度液相色谱仪的左泵按照设定的清洗溶剂程序将溶剂输入到固相萃取柱上清洗掉杂质，同时待分析物被富集在固相萃取柱上，待清洗过程完成后通过阀切换将在线固相萃取柱切换至分析流路，利用双梯度液相的右泵按照设定的分析色谱条件将待分析物从固相萃取柱上洗脱至分析柱上进行分离和分析。 图1.结构式示意图(A：甲萘威；B：百菌清) 图2.在线固相萃取-双梯度液相色谱分析原理图 (A：上样，清洗，萃取；B：洗脱，分离，分析) 测试条件 仪器：LU3000双梯度高效液相色谱仪，配置三元双梯度高压泵，自动进样器(2.5mL半制备进样组件)，柱温箱， DAD检测器 分析柱： Acclaim 120A， C18 (5um， 4.6×250mm)： 萃取柱： C18， 4.6mmx50mm， 3um； 流动相及阀位置： 流速：右泵：0.9ml/min；左泵：0.8ml/min 柱温：45℃ 检测波长：在0-14min， 280nm； 14-25min， 233nm进样量：2.5mL 表1.流动相条件，阀位置及切换时间 时间 阀位置 萃取(左泵) 时间 分析(右泵) 甲醇!(%) 水(%) 乙腈(%) 甲醇(%) 水(%) 0-4min 6-1 40 60 0-14min 65 35 4-25min 1-2 40 60 14-25min 10 70 20 样品的采集和保存 用清洗干净的磨口玻璃瓶装取湖水，立即置于冰水混合容器中，防止样品变质。在实验室中，样品可置于冰箱中4℃以下保存。 样品预处理 由于环境水体中通常存在悬浮物，泥沙等，如直接经过滤膜可能导致滤膜堵塞，待分析成分损失，因此水样在分析前，应置于高速离心机中，以转速12000rpm离心15min。离心后取上清液过0.22pm滤膜，进样测定。 结果与讨论 1.检测波长的选定 将甲萘威、百菌清分别在DAD上进行光谱扫描(见图3)，结果甲萘威在219nm，280nm有最大吸收；而百菌清在233nm，326处有最大吸收。为兼顾两者的灵敏度并最大程度降低干扰，本实验选择在280nm下检测甲萘威，在233nm下检测百菌清，采集的过程中利用仪器工作站的波长时间切换程序进行自动切换，根据色谱结果，即在14min中前采用280nm检测甲萘威，14min后采用233nm检测百菌清。 图3.甲萘威(A)、百菌清(B)光谱扫描图 2.流动相的选择 固相萃取柱流动相的选择：固相萃取的流动相比例对于清洗杂质、富集待分析成分至关重要。根据甲萘威和百菌清的性质，本文试验了甲醇：水(30：70；40：60；50：50)三种比例流动相，在30：70条件下，杂质清洗不完全，导致基线抬高；而在50：50条件下，洗脱能力又太强，导致甲萘威和百菌清在固相萃取柱柱上损失，回收率不高。综合试验结果，最终选定甲醇：水=40：60作为固相萃取流动相。 分析柱流动相的选择：初始选择了甲醇-水，乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-20MmKH，PO溶液作为初始条件进行摸索。结果这三种流动相对甲萘威的分离没有明显影响，而对百菌清的峰形影响明显。在甲醇-水条件 下，百菌清出峰较晚，与杂质分离不完全；在乙腈-甲醇-20MmKH，PO 条件下，百菌清分裂成两个峰。根据百菌清的结构，其有两个腈基氮，在偏酸性缓冲盐条件下可能增加其碱性，从而导致峰分裂。但如果在碱性条件下，则可能导致色谱柱寿命缩短，本文最终确定乙腈-甲醇-水作为流动相。 3.阀切换时间的确定 在确定固相萃取柱流动相比例后，阀切换时间的准确与否关系到甲萘威和百菌清与杂质分离的程度和回收率高低。当阀切换时间小于3min，杂质清洗不完全；大于5 min，甲萘威就开始穿透，导致回收率降低。综合各因素，最终确定阀切换时间为第4min。 4.固相萃取对色谱的影响及干扰判别 由于固相萃取的富集作用，从Millipore Simplicity 纯水机中取得的纯水作为空白样品，其色谱图在百菌清附近出现一个杂质峰(21.297)，原因可能是由于固相萃取的高富集作用导致其中的微量杂质也被富集。 该杂质峰的紫外光谱中，其最大吸收在246nm。而百菌清紫外光谱中，其最大吸收在233.2nm，可以初步鉴别，如图4所示。 图4.空白色谱图(A)及杂质峰(B)光谱图 5.线性关系 取甲萘威、百菌清标准品，分别制成浓度分别为0.02pg/mL， 0.05ug/mL， 0.1ug/mL， 0.2ug/mL和0.5pg/mL的标准溶液，取各标准溶液2.5mL注入液相色谱仪，依次测定。以测定的峰面积纵坐标，对应浓度为横坐标，做线性回归。结果甲萘威的线性关系：y=0.0480x+0.0137， 相关系数r=0.999997；百菌清线性关系： y=0.0756x-0.1829， 相关系数r=0.999967. 6.方法检测限与定量限 实验以0.02ug/mL标准溶液为参照，以3倍噪音为检测限，10噪音为定量限分别计算甲萘威与百菌清的检测限和定量限。结果甲萘威、百菌清的检出限分别为0.6ng/mL和0.4ng/mL；定量限分别为1.8ng/mL和1.3ng/mL。 2.6加标回收率试验 按实验方法测定，结果如图5所示。 ( [1]中华人民共和国卫生部 GB/T 5750-2006 生活饮用水标准检验方法[S].中国标准出版社，2006 ) ( [2]张平奇，杨丽莉，雷天学等.气相色谱/质谱联用法 测定水中甲萘威[J]，环境监测管理与技术，2009， 21(5)：52-53 ) ( [3]高庚申，谢蔚嵩，彭晓渝等.高效液相色谱法测定饮用水中甲萘威[J]，环保科技，2010，16(2)：37-39 ) ( [4]巢秀琴，曹杰.液液萃取气相色谱法测定生 活饮用水中的百菌清[J]，中国卫生检验杂志 [J]，2011，21(2)：356-358 ) ( [5]孙福生，董杰.环境水样中百菌清残留的单滴微萃取-反相液相色谱测定[J]，分析测试学报 []，2009，28(7)：863-866 ) 图5.标准品(A)及湖水样品(B)色谱图 结论 本文采用一种新型双梯度液相色谱结合固相萃取建立了一种简便、快速、准确测定环境水体中甲萘威和百菌清的液相色谱方法。该方法大大简化了国标方法和EPA测定方法的复杂性，同时在普及性极高的HPLC-UV仪器上实现了高灵敏度检测，可作为环境水体检测上述农药的常用方法。 表2.加标回收率结果 样品 甲萘威 百菌清 样品中含量(ng/mL) 加入量(ng/mL) 测得量 (ng/mL) 回收率(%) 样品中含量(ng/mL) 加入量 (ng/mL) 测得量 (ng/mL) 回收率% 湖水 未检出 19.8 18.8 94.95 未检出 19.4 20.8 107.2 19.9 18.2 91.46 19.3 21.1 109.3 19.9 18.9 94.97 19.8 20.9 105.6 19.5 18.2 93.33 19.9 21.3 107.0 19.6 18.5 94.39 19.5 20.5 105.1 河水 未检出 19.9 20.4 102.5 未检出 19.1 20.8 108.9 19.4 19.9 102.6 19.2 21.5 111.9 19.5 20.3 104.1 19.7 20.6 104.5 19.8 19.1 96.46 19.7 21.7 110.1 19.5 20.7 106.2 19.4 21.3 109.8 thermoscientific.com C 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. 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