谷物中T-2毒素检测方案(固相萃取)

「技术简报]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「技术简报] 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 目的 本文将介绍一种改良型QuEChERS提取方案和 简单的净化策略，适用于霉菌毒素的多残留UPLC-MS/MS分析。 应用背景 真菌毒素是由存在于家畜、饲料和食物上的霉菌或其它真菌产生的一类有毒化合物，摄取的食物仅含ppb (ug/kg)浓度的真菌毒素就有可能引发严重疾病。因此，我们需要灵敏可靠的分析方法来测定食品和饲料中的霉菌毒素。农产品中小麦、大米和玉米等是最易受到污染的谷物，因此也是监测的重点。这些谷物中有许多天然成分都是LC-MS/MS分析的干扰物。虽然蛋白质和淀粉可通过QuEChERS提取过程中的层析、沉淀和离心步骤去除，但是大量脂肪和卵磷脂(磷脂)仍会随目标物霉菌毒素被共同提取出来。 应用Oasis PRiME HLB小柱和DisQuE QuEChERS提取方法在谷物样品UPLC-MS/MS分析时可实现简单、高效的提取和净化的前处理解决方案。 图1.小麦面粉样品中添加了相应浓度的12种真菌毒素的色谱图。 这些共提物会干扰LC-MS分析、污染色谱柱和UPLC系统、质谱仪。传统方法主要采用正己烷脱脂或使用反相吸附剂(如硅胶C)去除提取物中的脂肪。尽管这些技术可有效去除脂肪，但它们都无法去除磷脂。 解决方案 使用Oasis PRiME HLB小柱进行通过式净化以去除脂肪和磷脂；通过dSPE(分散SPE)净化去除列留的糖类和其它极性物质。应用上述净化方案可以得到满意的回收率。 实验步骤 QuEChERS提取：取市购小麦粉。称取2g样品，装入50 mL离心管中。加入10 mL水和10mL甲酸/乙腈(10：90)溶液，将样品置于自动振荡器中振摇1h。然后加入QuEChERS盐(用于CEN方法的DisQuE提取盐包，部件号186006813)，用手大力振摇1 min。离心(3200转/分钟， 5 min)后，取出一部分上清液进行净化。 净化：将Oasis PRiME HLB小柱(3cc， 150 mg，部件号186008717)安装在预先清洁过且设置为最小真空度(大约2 psi)的空空萃取装置上。无需执行小柱活化步骤。取约0.4mL上清液，使其通过Oasis PRiME小柱并滤去滤液。然后再取1mL上清液，再次通过小柱并收集滤液。然后将收集到的流出液转移到含有混合吸附剂的2mLdSPE管(部件号186008081)中。在13500转/分钟下离心1min， 取500uL上清液，在温和的氮气流中挥干，然后复溶于250 uL乙腈/水(15：85)中。 仪器条件 UPLC-MS/MS仪器条件如右侧所示。表1列出了本应用的目标化合物、MRM多反应监测通道和质谱参数。每种真菌毒素使用空白基质配置标准曲线，在6个不同浓度的范围内具有良好的线性关系，相关系数R2>0.99. UPLC条件 LC系统： ACQUITY UPLC I-Class (FTN) 色谱柱： CORTECS°UPLC T3， 1.6 um， 100 x2.1 mm流动相： A：含有0.5%甲酸和5mM甲酸铵的水溶液B：含有0.5%甲酸和5mM甲酸铵的 甲醇/乙腈(50：50)溶液 流动相梯度洗脱程序： 时间 %A %B 起始 95 5 1 95 5 6 30 70 6.5 5 95 7.5 1 99 9.7 1 99 10 95 5 11 95 5 进样体积： 10pL 柱温： 30°℃ 洗针液和样品管理器冲洗液：1%甲酸，10mM柠檬酸的水溶液/甲醇/异丙醇/乙腈(1：1：1：1) 密封清洗液： 甲醇/水(10：90) MS条件 质谱仪： Xevo°TQ-S micro 离子源： ESI+ 离子源温度： 150℃脱溶剂气温度： 500°℃脱溶剂气流速： 1000L/h 锥孔气流速： 30 L/h 数据管理系统： MassLynx4.1版 实验结果 本应用测定了12种毒素在低浓度和高浓度下的回收率。高浓度为欧盟规定的黄曲霉毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的最高允许浓度，以及T2和HT2毒素的推荐浓度(见图1)。低浓度为高浓度的1/4(黄曲霉毒素的浓度为0.25 ng/g)。小麦面粉中在低浓度和高浓度加标样品中除玉米赤霉烯酮(回收率在73%)外，所有目标化合物的方法回收率均大于80%。大米和玉米面粉样品的结果与之相当。 应用通过式净化或dSPE净化步骤对真菌毒素的损失极小。图1显示了加标浓度为1ng/g (ppb)黄曲霉毒素的小麦面粉样品的色谱图。图2为Oasis PRiME小柱去除磷脂的效率的比较色谱图；显示了使用Oasis PRiME小柱成功去除了95%以上的磷脂和80%以上的总脂肪。 真菌毒素 保留时间 (min) MRM通道 锥孔电压 (V) 碰撞电压 (eV) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 3.02 297.1>249.1 15 15 297.1>231.1 15 18 4.80 331.2>245.1 20 25 黄曲霉毒素G2 331.2>257.1 20 30 4.99 329.2>283.1 20 25 黄曲霉毒素G1 329.2>243.1 20 35 黄曲霉毒素B2 5.10 315.2>259.1 20 33 315.2>287.1 20 30 黄曲霉毒素B1 5.27 313.2>241.1 15 40 313.2>285.1 15 28 伏马菌素B1 5.70 722.4>334.2 30 40 722.4>352.2 30 35 HT-2毒素 5.72 442.2>263.1 20 15 442.2>215.2 20 15 赭曲霉毒素B 6.06 370.1>205.1 20 25 370.1>205.2 20 24 T-2毒素 6.30 484.2>305.1 25 9 484.2>245.1 25 9 伏马菌素B2 6.47 706.4>318.2 35 40 706.4>336.2 35 40 玉米赤霉烯酮 6.57 319.2>187.1 15 15 319.2>283.1 15 13 赭曲霉毒素A 6.60 404.2>239.1 20 25 404.2>358.2 20 16 表1.每种目标化合物的MRM通道和质谱条件(注： HT-2和T-2毒素的MRM监测通道采用其铵加合物；为了增强响应，流动相中添加了甲酸铵)。 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. ( Waters， The Science of What’s Possible、ACQUITY UP L C、CORTECS、Xevo、Oasis和MassLynx 是沃特世公司的注册商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ) 图2.使用Oasis PRiME HLB进行通过式净化；几乎完全去除了小麦面粉QuEChERS提取物中的磷脂。 结论 ( 实验证明，经改良的QuEChERS提取方案能够有效地从小麦、大米和玉米面粉中同时提取出12种真菌毒素。 ) 使用Oasis PRiME HLB小柱进行通过式净化可有效去除QuEChERS提取液中80%以上的脂肪和95%以上的磷脂。 使用混合吸附剂的dSPE净化能有效去除QuEChERS提取液中的极性共提取物。 按本应用进行样品制备，并使用Xevo TQ-S micro质谱仪进行LC-MS/MS分析，可满足欧盟法规标准的定量限LOQ的要求。 @沃特世公司。中国印刷。H RF-PDF 本文将介绍一种改良型QuEChERS提取方案和简单的净化策略，适用于霉菌毒素的多残留UPLC-MS/MS分析。真菌毒素是由存在于家畜、饲料和食物上的霉菌或其它真菌产生的一类有毒化合物，摄取的食物仅含ppb (g/kg)浓度的真菌毒素就有可能引发严重疾病。因此，我们需要灵敏可靠的分析方法来测定食品和饲料中的霉菌毒素。农产品中小麦、大米和玉米等是最易受到污染的谷物，因此也是监测的重点。这些谷物中有许多天然成分都是LC-MS/MS分析的干扰物。虽然蛋白质和淀粉可通过QuEChERS提取过程中的层析、沉淀和离心步骤去除，但是大量脂肪和卵磷脂(磷脂)仍会随目标物霉菌毒素被共同提取出来。