调经益母片中迷迭香酸的含量检测方案(制备液相色谱)

2Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.ThermoSCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific HPLC法测定调经益母片中3种水溶性成分的含量 余彦海 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Key words： Tiaojing Yimu Tablet； aldehyde；；rosmarinic acid；salvianolicacid B；；HPLC 调经益母片由益母草、丹参、冰糖草提取加工而成的妇科中成药，具有调经活血，祛瘀生新的功效。长期临床应用表明其用于月经不调，经期腹痛，产后瘀血不清、子宫收缩不良具有良好疗效。现代药理学研究显示调经益母片可提高雌二醇的含量，增强子宫平滑肌的收缩强度，提高小鼠对热刺激的痛阈值等作用。丹参作为其主要药味，其具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神的作用3，正与其功能主治相合。在调经益母片原标准中，仅对丹参进行了丹参及原儿茶醛的薄层色谱鉴别。而丹参所含的迷迭香酸、丹酚酸B亦是具有上述功能主治的已知主要药效成分同。本文采用高效液相色谱法，首次建立了调经益母片中原儿茶茶、迷迭香酸和丹酚酸B的含量测定方法，为该制剂质量标准的提高提供参考依据。 测试条件 仪器：U3000高效液相色谱，自动进样器，柱温箱，可变波长检测器 分析柱： Acclaim 120A， C18(5um， 4.6×250mm)： 流动相：乙腈(A)-1mL·L1磷酸(B)，梯度洗脱：0~15min， 17%~23%A； 15~30min，23%~25%A； 30~40min， 25%~90%A； 检测器：检测波长280nm； 流速：1mL·L1； 柱温：25℃； 进样量：10pL。 取调经益母片10片，除去糖衣，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.5mL·L1磷酸甲醇溶液25mL，定质量，置超声清洗仪中超声提取30min，放冷，再称定质量，用0.5mL·L1磷酸甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 1.检测波长的选定 原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B是丹参药材中主要药效成分，均为水溶性成分。而调经益母片采用的提取工艺为水提取，能够有效提取出上述成分。因此，测定上述成分能够代表丹参以及调经益母片的质量，并且显示成品的质量控制指标与药效成分的一致性。经紫外波谱扫描，上述3种成分的在280nm均有良好的吸收，因此选择280nm作为同时测定3种成分的波长。 2.流动相的选择 参考文献，本文实验了乙腈-1mL·L1磷酸，乙腈-0.5mL·L1磷酸和甲醇-水溶液，结果发现，甲醇-水系统各峰拖尾严重，影响峰的识别和定量；而乙腈-1mL·L'磷酸，乙腈-0.5mL·L'磷酸均显著改善各物质峰形，只是在原儿茶醛附近，乙腈-0.5mL·L1磷酸对杂质峰的分离不如乙腈-1mL·L'磷酸。也有文献⑧报道采用甲醇-水-冰醋酸(11：89：1)做等度分析时测定丹参素和原儿茶醛。但考虑到本实验与之测定成分存在差异，且在测定过程中要进行复杂梯度，流动相中冰醋酸的存在会一定程度上影响基线的平稳，因此不予采用。综上，本文最终选择后者，即乙腈-1mL·L1磷酸作为流动相。 3.提取条件的选择 本文在样品提取时，试用了水，体积分数50%甲醇，0.5mmL·L1磷酸甲醇溶液作为提取溶剂，结果显示，0.5mmL·L1磷酸甲醇提取的样品色谱图中，原儿茶醛干扰最少，而其他2个成分3者效果基本一致。在溶剂用量上，取样1g加0.5mL·L'磷酸溶液和甲醇共25mL均能完全提取出3者的量。综合上述实验结果，确定提取方式为：取样品1g，0.5mL·L'磷酸甲醇溶液25mL，超声30min。 分别精密吸取2.2项中对照品储备液0.1，0.5，1，2和3mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。在上述色谱条件下，分别进样10pL，记录色谱图。以各对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：原儿茶醛： Y=251.2X+6.4155， y=0.9999；迷迭香酸的回归方程为： Y=121.76X-5.4298， y=0.9998；丹酚酸B的回归方程为： Y=258.32X-7.8857， y=0.9996， 表明 原儿茶醛、迷迭香失、丹酚酸B分别在1.506~45.18，3.026~90.78和6.545~196.35pg·L线性关系良好。 5.精密度实验 精密吸取混合对照品溶液(原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B质量浓度分别为15.06，30.26和65.45pgL')10pL，按上述色谱条件下重复进样6次，，原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.52%，0.87%和0.79%。 6.重复性实验 取批号101008样品，照2.3项下方法，平行制备供试品溶液6份，依法测定，测定该6份样品中原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量，计算RSD。结果原儿茶醛的RSD为1.05%，迷迭香酸的RSD为0.99%，丹酚酸B的RSD为1.31%。 7.加标回收率 取批号101008样品0.5g，共6份，加入2.2项中各对照储备液1mL，照2.3供试品溶液的制备中制备成供试品溶液，按照上述方法测定其中原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量，分别计算3者的回收率。结果原儿茶醛回收率为96.2%， RSD为1.1%；迷迭香酸回收率为98.1%， RSD为0.83%；丹酚酸B回收率为97.7%， RSD为0.91%，详细数据参见表1。 取3批调经益母片，照2.3项下制备供试品溶液，每批样品制备平行样2份，测定。计算样品中3种成分含量，结果100301，101008和101201中原儿茶醛分别含0.11，0.09和0.122mg·片1；迷迭香酸分别含0.26，0.22和0.24mg·片1；丹酚酸B分别含0.48，0.44和0.42mg·片。 成分 取样量(g) 样品中含量 /mg 加入量/mg 汉测得量/mg 回收率/% 平均回收率 /% RSD/ % 原儿茶醛 0.4991 0.1698 0.1506 0.3145 98.14 96.2 1.1 0.4822 0.1640 0.1506 0.3088 95.68 0.4931 0.1677 0.1506 0.3143 95.88 0.5001 0.1701 0.1506 0.3136 95.29 0.4860 0.1653 0.1506 0.3155 96.75 0.4739 0.1611 0.1506 0.3057 96.02 迷迭香酸 0.4013 0.3026 0.7012 99.14 98.1 0.83 0.4029 0.3026 0.6989 97.82 同上 0.4039 0.3026 0.6981 97.12 0.4001 0.3026 0.6975 98.28 0.4046 0.3026 0.6987 97.19 0.4081 0.3026 0.7068 98.71 丹酚酸B 0.6545 0.7409 1.3740 96.88 97.7 0.91 0.6502 0.7409 1.3678 96.86 同上 0.6571 0.7409 1.3829 98.79 0.6589 0.7409 1.3785 97.13 0.6511 0.7409 1.3687 98.58 0.6530 0.7409 1.3743 98.19 ( [1]冷方南.中国基本中成药[M]. 北京：人民卫生出版 社， 1988：267. ) ( [2]周玖瑶，益益源，李锐，等.调经益母片的药理作用[J].广州中医药大学学报，1 9 98，15 (3)：213. ) ( [3]国家药典委员会.中国药典2010年版[S]. 一部 . 北京：中国医药科技出版社，2010：70-71. ) ( [4]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂[S].第十四册. 1997：145 ) ( [5]李朝霞，王地.丹参水溶性成分的研究进展[J].北 京中医，2004，23， )， (3)：176-178. ) ( [6]Zheng-Fu Zhang， Hong-Shan Chen， Zhuo-Rong Li. Simultaneous determination of five bioactive phenolic a cids in Salvia yunnanensis and Salviamiltiorrhiz a b y HPLC[ J ]. J Chin Pharmaceut Sci， 2010，19：271-278. ) ( [7]张慧娴，杜守颖，陆洋，等.HPLC同时测定丹参水溶性及脂溶性5种成分的含量[J].中国实验方剂 学杂志，2010，16(15)：34-38. ) ( [8]陶春梅，于治国，袁璐，等.丹参药材中丹参素和原儿茶醛含量的HPLC测定法[J].西北药学杂志， 2006，21(8)：155-156. ) thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fish e r Scientific Inc. All ri g h ts res e rved. All tra d emarks a re the p r operty of The r mo Fisher S c ientific Inc. and itssubsidiaries. Specifications， t erms a n d pr i cing are su b ject to chan g e. Not all pro d ucts are avail a ble in all countries. Plea s e consult yourlocal sales representative fo r de t ails. ) 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 由编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548