奶粉中山梨糖检测方案(液相色谱仪)

[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] Waters ACQUITY UPLC-ELSD 测定奶粉和牛奶中八种糖的含量 赵淑军 沃特世科技(上海)有限公司北京实验室中国 关键词 超高效液相色谱奶粉牛奶Fructose(果糖))Sorbose(山梨糖)Glucose (葡萄糖)Sucrose (蔗糖) Maltose (麦芽糖)Lactose (乳糖)) Maltotriose(麦芽三糖)Maltotetraose (麦芽四糖) 实验方法 1.材料、试剂和仪器 乙腈为色谱纯，三乙胺为优级纯，实验用水为超纯水(18M， TOC 3ppb)， 牛乳清蛋白标准品Ba-La、BBb-Lg和BBa-Lg： ACQUITYUPLC超高效液相色谱系统， ACQUITY ELSD检测器， FILTER MIXER (425pl， P/N 205000403) 2.色谱条件 液相系统： Waters ACQUITY UPLC配ACQUITY ELSD蒸发光检测器 色谱柱： ACQUITY UPLC BEHM Amide 2.1mm x100mm， 1.7 um 柱温： 35℃ 分析时间： 18min 进样量： 5ul(样品进样2ul) 流动相： A：水B： 0.2%TEA溶腈溶液，梯度洗脱 弱洗溶剂： 乙腈/水=90/10，800ul 强洗溶剂： 乙腈/水=10/90， 500ul 进样方式： 不充满定量环(使用针溢出) ELSD条件： 增益： 500 数据率： 10pps 喷雾器模式： 冷却 漂移管温度： 55℃ 气体压力： 30psi 实验室试验温度：20℃ 实验室试验湿度：45% 工作电源： 220V稳定电源 梯度方法见下表： 表1检测梯度表 时间/(min) 流量/(ml/min) A% B% 曲线 0 0.15 15 85 初始 2 0.15 22 78 6 11 0.15 50 50 4 18 0.15 15 85 1 3.数据处理系统 Empower2 4.前处理方法 称取2.0g奶粉样品或5ml液态奶样品，加入20mL(对于液态奶添加15ml)1/1的乙腈水溶液溶解，手摇震荡混匀，然后均质混匀2分钟，室温下8000r/min 离心15分钟，取上清液过0.2um 滤膜；对于某些样品由于糖含量很高，所以过滤后的样品可能需要用乙腈/水=70/30的溶液稀释一定倍数后，进样检测。 结果与讨论 1.标准配制 八种糖标准分别称取10mg，用1/1的乙腈水定容1ml，然后用乙腈/水=70/30的溶液稀释配制各个浓度的标准品，进行实验。 2.八种糖UPLC分离检测色谱图及数据 图1八种糖UPLC分离检测色谱图 图1是八种糖50ppm混合标准品用UPLC (ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱)分离，ELSD检测的色谱图，按照保留时间顺序分别是： Fructose(果糖))、Sorbose (山梨糖)、 Glucose(葡萄糖)、Sucrose(蔗糖)、Maltose(麦芽糖)、Lactose (乳糖)、Maltotriose(麦芽三糖)、Maltotetraose (麦芽四糖)；单括5种单糖和3种多糖。有关数据见下表。 表2八种糖标准品分离分析数据 名称 保留时间(分钟) 面积(微伏*秒) %面积 高度(微伏) 峰类型 USP分离度 s/n Fructose 5.745 346696 7.83 53883 找到 58 Sorbose 5.995 529662 11.96 97981 找到 1.6 106 Glucose 6.704 418246 9.45 53922 找到 4.0 58 Sucrose 8.041 1117350 25.24 335744 找到 9.0 363 Maltose 8.529 476565 10.77 96141 找到 4.7 104 Lactose 8.690 716329 16.18 193308 找到 1.5 209 Maltotriose 9.624 492501 11.13 138706 找到 9.9 150 Maltotetraose 10.399 329529 7.44 98605 找到 8.5 107 其中较难分离的Fructose(果糖)和Sorbose(山梨糖))、Maltose(麦芽糖)和Lactose(乳糖)均分别达到1.6、1.5的分离度。 3.方法的检出限 如图2所示， 为5ppm的混标色谱图，此浓度下按保留时间顺序八种糖的信噪比分别达到3、5、5、24、6、12、5和3，(进样量10ul)： 图2 5ppm的混标色谱图 可见，八种糖中Fructose(果糖)、Sorbose (山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Maltose (麦芽糖)、Maltotriose (麦芽三糖))和Maltotetraose (麦芽四糖)的检测限为5ppm；此浓度下Lactose(乳糖)可达到定量限，而Sucrose(蔗糖)的定量限可以到达2ppm。 4.方法的线性相关性 浓度分别为5.000、10.000、20.000、50.000、100.000、150.000 mg/L的八种糖标准品依次进样，进样量均为5EL，外标法定量。以峰面积A的lg值为纵坐标，浓度C的lg值为横坐标进行线性回归，得到8种糖的线性方程、复相关系数和线性曲线图如图3-图10所示，在5.000-150.000mg/L范围8中糖均具有良好的lg-lg线性关系。 图3 Fructose工作曲线和方程 图4 Sorbose工作曲线和方程 图5 Glucose工作曲线和方程 图6 Sucrose工作曲线和方程 Equation：Y=1.67e+000X+ 0.999； Equation：Y=1.60e+000 X+2.99e+000 2.70e+000 图7Maltose工作曲线和方程 图8 Lactose工作曲线和方程 图9 Maltotriose工作曲线和方程 图10 Maltotetraose工作曲线和方程 5、实际样品检测结果 从市场取某一奶粉样品，进行实际提取实验，进样检测，色谱图及结果数据见图11所示，可以看出此样品中含有蔗糖、乳糖、麦芽三糖和麦芽四糖四种糖成分，同时发现蔗糖和乳糖得含量相当高，已经超出检测器的响应范围；因此将此此品稀释100倍后再次进样检测，结果数据见图12。 分钟 名称 保留时间(分钟) 面积(微伏*秒) %面积 高度(微伏) 积分类型 含量 单位 Frucose 5.746 丢失 Sorbose 5.991 丢失 Glucose 6.685 丢失 Sucrose 7.985 16353040 32.80 1954279 BB 7001.522 ug/g Maltose 8.518 丢失 Lactose 8.633 32180012 64.55 1942011 BB |4380.591 ug/g Maltotriose 9.636 960560 1.93 247390 BB 1901.108 ug/g Maltotetraose 10.419 359170 0.72 111859 BB 1333.102 ug/g 图11奶粉提取样品色谱图及结果数据 分钟 图12奶粉提取样品稀释100倍色谱图及结果数据 ( 由图11和12的数据可以知道此奶粉中含有蔗糖16.8mg/g、乳糖140.1mg/g、麦芽三糖和麦芽四糖的含量分别只有1.9mg/g、1.3mg/g。某液态奶提取后，稀释100倍检测结果见图13。 ) 图13液态奶提取样品稀释100倍色谱图及结果数据 6、重现性 首先用50ppm混合标准6次连续重复进样，考察标准品在本方法下的稳定性，见图14所示重叠色谱图，重复数据见表3、表4。 样品名称suger-090725 50ppm 6；进样1；采集日期2009-7-2322：24：09 CST 图14 50ppm标准品6次连续进样重叠色谱图 表38种分析物标准6次连续进样保留时间重现性 组份摘要：保留时间 样品组名 采集日期 Fructose (分钟) Sorbose (分钟) Glucose (分钟) SSucrose (分钟) Matose (分钟) Lactose (分钟) Matotriose (分钟) Matoteraose (分钟) 1 tang_090725 2009-7-2322：05：13CST 5.740 5.994 6.707 8.045 8.532 8.697 9.635 10.406 2 tang_090725 2009-7-2322：24：09CST 5.740 5.992 6.704 8.039 8.526 8.691 9.629 10.398 3 tang 090725 2009-7-23 21：08：23CST 5.745 5.995 6.704 8.041 8.529 8.690 9.624 10.399 4 tang_090725 2009-7-23 21：46：15CST 5.748 5.988 6.695 8.037 8.519 8.691 9.638 10.417 5 tang_090725 2009-7-2320：49：28CST 5.749 5.992 6.678 8.037 8.520 8.687 9.630 10.406 6 tang _090725 2009-7-23 21：27：19CST 5.752 6.001 6.700 8.039 8.527 8.687 9.637 10.416 Mean 5.746 5.993 6.698 8.040 8.525 8.691 9.632 10.407 Std.Dev. 0.01 0.00 0.01 0.00 0.01 0.00 0.01 0.01 %RSD 0.09 0.07 0.16 0.04 0.06 0.04 0.06 0.08 组份摘要：面积 样品组名 采集日期 Fructose (微伏*秒) Sorbose (微伏*秒) Glucose (微伏*秒) Sucrose ((微伏*秒) Matose Lactose Matotriose (微伏*秒) Matoteraose (1'微伏*秒) tang_090725 2009-7-2322：05：13CST 354618 545060 438062 1140458 487672 726145 506344 326732 2 tang_090725 2009-7-23 22：24：09CST 356083 534300 437821 1132175 481857 728233 499234 323316 3 tang_090725 2009-7-2321：08：23CST 355120 547474 438539 1124477 478193 718707 504888 336143 4 tang_090725 2009-7-2321：46：15CST 350116 538270 447919 1115084 478887 738904 501336 326372 5 tang_090725 2009-7-23 20：49：28CST 361989 555435 443986 1108920 476046 731810 514378 345616 6 tang_090725 2009-7-23 21：27：19CST 357658 553336 447541 1116876 472319 731942 489793 327559 Mean 355931 545646 442311 1122998 479162 729290 502662 330956 Std.Dev. 3896.4 8267.9 4775.9 11743.7 5238.9 6765.1 8184.1 8373.6 %RSD 1.1 1.5 1.1 1.0 1.1 0.9 1.6 2.5 提取奶粉实际样品，由于乳糖含量较高，将其稀释了100倍，然后在不同天次连续3天进样检测，考察本方法对于实际样品天间的重现性情况，如图15所示是该实际样品3天内3次进样的重叠色谱图，有图可见该方法对实际样品在天间具有较好的重现性。 结论： 本方法建立了用Waters UPLC-ELSD系统检测奶粉和牛奶实际样品中Fructose(果糖)、Sorbose (山梨糖)、Glucose(備萄糖)、Sucrose (蔗糖)、Maltose (麦芽糖)、Lactose (乳糖)、Maltotriose(麦芽三糖)、Maltotetraose (麦芽四糖)8种常见糖的的定量分析方法。方法的检出限为有6种糖达到5pg/g，两外两种糖Sucrose和Lactose在5ug/g下的信噪比可达到24和12。使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱和三乙胺流动相体系，8种糖均实现基线分离，可以用于奶粉和牛奶中常见这8种糖的含量测定。 图15实际奶粉提取样品天间重叠色谱图 ( 参考文献： ) ( Waters ACQUITY U PLC B EH Amide Columns Care 8 Use， P / N：715001371 ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE." ◎2012年沃特世公司。于中国印制2012年10月