动物组织中克伦特罗残留检测方案(液质联用仪)

ApplicationNote： CM0032Part of Thermo Fisher Scientific 在线净化LC-MS/MS系统对动物组织中克伦特罗残留的检测分析 赵孔祥王海鉴” 1天津出入境检验检疫局食检中心2赛默飞世尔科技(中国)有限公司 克伦特罗俗称瘦肉精，常被用作饲料添加剂以提高家畜的瘦肉含量，但由于其严重的毒副作用，欧盟于1988年1月1日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。1991年被FDA禁止。1997年，中华人民共和国农业部下文严禁β-腎上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸克伦特罗列为第一位。2009年7月为应对日、韩从我国食品中检出盐酸克伦特罗事件，质检系统确定了了更严格的出口判定标准(0.05pg/kg)，食品检测已经进入超痕量时代。 在此背景下，我们需要更有效的前处理手段以便我们得到更加浓缩更加纯净的样品来提高我们的信号降低我们的噪音。基于色谱原理的创新样品制备方法--Turbo Flow技术为我们提供了新的思路。这种在线自动过程处理技术结合了扩散、化学和体积排除的原理，在捕获感兴趣分析物的同时，快速消除基质干扰。本实验旨在建立一个前处理简单，选择性灵敏度高的克伦特罗的Turbo Flow实用在线净化方法，并确定该方法的检出限。 1实验部分 1.1样品制备 取5g动物组织样品与10mL乙腈，10%乙酸铵(1：3)混合溶液混匀匀浆10分钟，5000r/min离心十分钟取1mL上清液经过0.22pm注射过膜，上机。 1.2 Turbo Flow条件 系统： Thermo Scientific Aria TLX-1 controlled by AriaTM software 在线净化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.5 X 50mm 进样体积： 50uL 上样溶剂： 0.1%的甲酸水溶剂 上样流速： 2mL/min 洗脱溶剂： 1%的氨水甲醇溶液 洗脱体积： 50pL 1.3 HPLC 方法条件 色谱柱： Hypersil GOLD aQ 3pm 100X2.1mm 流路A：0.1%的甲酸水溶液 流路B：甲醇 时间(min) A% B% 流速mL/min 90 10 0.4 1 90 10 0.4 2.33 80 20 0.4 2.83 60 40 0.4 6 10 90 0.4 6.5 10 90 0.4 8 90 10 0.4 Start Data Window1.00 minData Window Length7.65 min 图1 Turbo Flow在线净化与HPLC联用方法参数 1.4质谱条件 1.4.1调谐参数 系统 TSQ Ultra AM 离子源极性： 正离子模式 喷雾电压： 4500V 鞘气压(N2)： 50arb 辅助气压(N2)： 16arb 毛细管柱温度： 350℃ 碰撞气体(Ar)： 1.5mTorr Skimmer offset 10V Q1/03峰分辨度： 0.7u(单位质量) 1.4.2 SRM反应参数 被分析组分 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(V) 管透镜电压(V) 克伦特罗-D9 286 169.1 28 104 克伦特罗 277 132.2 29 94 168.1* 28 94 203.6 15 94 2结果与讨论 食物样品本身基质比较复杂，在进行检测之前往往需要一个较长的样品预处理过程。比如贾晓飞等使用酶解，高氯酸沉淀蛋白，邵兵等应用HLB和MCX两次SPE对食品中β2-受体激动剂进行残留检测都取得了很好的效果，这些方法的目的也都是为了获得更加浓缩和纯净的样品。应用Turbo-Flow在线净化技术使得这些工作变得更加简洁方便，减少了中间步骤和偶然误差，使得加标回收的重复性很稳定， 0.05pg/kg浓度下六平行RSD为5.36%；同时由于样品更加纯净浓缩，干扰较少，此方法在添加量为0.02pg/kg浓度下峰型良好(如图2所示)。根据欧盟法规计算此方法检出限(LOD)为0.002ug/kg，定量限为0.006pg/kg已经能轻松应对实际需要。同时如果有实际需要，i可以采用更长的净化柱(100mm规格)或者采用串联净化柱的方法进一步增加样品浓缩倍数，来提高检出限。 图2 0.02pg/kg浓度色谱图 由于采用了在线净化系统，进入分析色谱柱的样品也更为纯净，，-一定程度上降低了噪音和杂峰的产生。如图3所示， 采用Turbo Flow技术代-—-定程度上起到了稳定基线的作用。 图320pg/g添加回收比较图。左图为MCX固相萃取净化，右图为在线净化结果 运用Transcend在线净化系统的操作软件Aria OS的变量设置功能，可以方便设置批处理程序尝试不同的洗脱溶液。在比较不同浓度的氨水甲醇溶液后，结果表明1%的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液的效果最优。使用外标法计算其与不经过净化柱的结果得到其绝对回收率为79~84%。而且此浓度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min的速度与0.4mL/min的分析柱溶液混合不会对高效液相色谱产生不良影响，在使用此方法千针后，10个平行的保留时间RSD仍然只有0.1%。 分别配置5pg/mL，10pg/mL， 20pg/mL， 50pg/mL， 100pg/mL， 200pg/mL， 500pg/mL， 1ng/mL， 2ng/mL的克伦特罗标准溶液，其中都混有100pg/mL内标，内标法定量得到标准曲线有很好的线性(曲线见图3)，相关系数R2为0.9995 向5g动物组织中分别添加100pg、250pg、500pg克伦特罗标准，内标法定量，计算其回收率结果表明，经过在线净化和内标法校正后样品回收率非常稳定。简单的前处理步骤带来最少的偶然误差。 表1克伦特罗不同添加水平回收率 添加水平 平均回收率% RSD%* 20pg/g 94.2 5.58 50pg/g 96.5 5.36 100pg/g 94.4 2.49 *为六平行水平下RSD值 CLENBUTAROL 3结论 采用Turbo Flow在线净化技术可以非常方便的按要求得到更加浓缩，干扰更少的样品，提高了信噪比，降低了检出限。 Turbo Flow在线净化技术简化了前处理步骤，减少了偶然误差获得了令人满意的重现性。 使用Aria OS操作系统，我们可以很方便的设置批处理变量，尝试不同种类或者比例的上样或者洗脱溶剂。 ( 1 Lee D W， Mona I C ， Daniel R D. J Chromatogr B. 2004 ， 813 ： 35-45 ) ( 2 Jose B ， Patricia M， Miguel M， et al. Anal Chim Acta. 2005， 529：199-205 ) ( 3 Doerge D R，Churchwell M I，Holder C L ， et al.Anal Chem，1996，68(11)：1918 ) ( 4 Joseph HWL a nd Cheang S K . J AOAC Int. 2 004， 87 ： 31-38 3 贾晓飞，蔡增轩，潘红锋 ) ( 5任一平.超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法检测动物组织中的20种β2-受体激动剂的残留 . 卫生研究 2007 ， 04 ) ( 6吴国华，邵兵，孟娟.气相色谱-质谱测定尿液中的克 伦特罗.中国公共 卫 生， 2 0 0 4，20 (2)：235~236 ) 我们需要更有效的前处理手段以便我们得到更加浓缩更加纯净的样品来提高我们的信号降低我们的噪音。基于色谱原理的创新样品制备方法--Turbo Flow技术为我们提供了新的思路。这种在线自动过程处理技术结合了扩散、化学和体积排除的原理，在捕获感兴趣分析物的同时，快速消除基质干扰。本实验旨在建立一个前处理简单，选择性灵敏度高的克伦特罗的Turbo Flow实用在线净化方法，并确定该方法的检出限。