苦丁茶中果糖检测方案(固相萃取仪)

维普资讯 http：//www.cqvip.com茶叶科学2006，26(3)：195~198Journal of Tea Science 维普资讯 http：//www.cqvip.com茶叶科学26卷196 采用 GC 法分析苦丁茶中可溶性单糖的研究 姜波，关紫烽，白松涛，范圣第 ( 大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600) 摘要：通过恒温水浸泡，干燥后利用二甲基亚砜(DMSO)作溶剂，六甲基二硅胺烷(TMDS)和三甲基氯硅烷(TMCS) 作硅烷化试剂，将单糖衍生化为三甲基硅醚衍生物，以肌醇为内标物，用 SE-30毛细管色谱柱，测定了苦丁茶中单糖的组成及含量。同时对比了二甲基酰胺及吡啶的溶解能力和 N，O-双三甲基硅烷基乙酰基(BSA)的衍生化效果。方法的相对标准偏差小于 8.0%，测得的苦丁茶中单糖含量分别为：葡萄糖0.355%，果糖0.440%，半乳糖4.000%，核糖0.035%，木糖0.150%，阿拉伯糖0.006%。 关键词：苦丁茶；可溶性单糖；硅烷衍生化；气相色谱；内标法 中图分类号：0657.7*1， Q532 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2006)03-195-04 Determination of Soluble Monosaccharide in ZlexLalifotia Thumb by GC JIANG Bo， GUAN Zi-fng， BAI Song-tao， FAN Sheng-di (College of Life Science， Dalian Nationalities University， Dalian 116600， China) Abstract： Monosaccharide in Kuding tea ( Zelex lalifotia thumb) was obtained by dipping Kuding Tea in water bathwith constant temperature， and then drying till the extract solution dryness. The dried monosaccharide was derivedinto trimethylsilyl derivative with hexamethyedisilane(HMDS) and trimethylchlorosilane(TMCS)， and dimethylsulfoxide(DMSO) used as solvent. The monosaccharide was determined by GC with SE-30 capillary column， andmyoinositol used as internal standard. The dissolving ability of dimethylformamide and pyridine were compared andthe derivative effect ofN， O-bitrimethylsilylacetamide (BSA) was determined. The relative standard deviations werebelow 8.0%. The contents of monosaccharides in Kuding tea were as follows： glucose(0.355%)， fructose(0.440%)，galactose(4.000%)， ribose(0.035%)，xylose(0.150%)， arabinose(0.006%). Key words： Kuding Tea， Soluble Monosaccharide， Trimethylsilyl Derivatization， Gas Chromatography， InternalStandard Method 苦丁茶系由冬青科(Aqifolilceae) 植物一苦丁茶冬青之叶加工而成。主要分布在长江以南亚热带海拔800~1500 m之间冷凉山区的山谷和山坡中下部杂木林中，广西、广东、四川、贵州和海南等地分布较广，近年湖南、福建、浙江、安徽也有栽培。据临床证明苦 丁茶具有清热解毒、杀菌消炎、活血脉、降血脂、降胆固醇、降血压、减肥、抗生育等功效[1.21。经现代仪器检测，苦丁茶含有医学界公认的抗癌物质一硒化物。由于苦丁茶有较高的治疗保健作用，近年来，人们对苦丁茶的化学成分进行了多方面的研究，已检测 ( 收稿日期：20 0 5-11-22 修订日期：20 0 6-07-11 ) ( 作者简介：姜波(1960-)，女，高级工程师，硕士研究生在读，主要从事大型分析仪器在生物及食品分析方面的应用，生物体中有效 成分的提取及结构鉴定等。E-mail：jb@dlnu.edu.cn ) 出其中的苦丁茶甙元、多种氨基酸、苦丁皂甙、黄酮类化合物、维生素、咖啡碱、茶多酚、熊果酸、蛇麻酯醇、蒲公英赛醇、原儿茶酸等成分[2~4)。同时分析了苦丁茶中可溶性糖总糖及还原糖等。但对苦丁茶中可溶性单糖组成及含量未见报道。 本文通过采用恒温浸泡提取、干燥、衍生化后，以肌醇为内标物，采用气相色谱法测定了苦丁茶中可溶性糖的组成及含量，为进一步研究苦丁茶的药理及保健作用提供了重要的参考依据。 1实验部分 1.1仪器与试剂 仪器为 GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)，氢火焰离子化检测器(FID)， GCSolution 工作站。 二甲基亚砜(DMSO)、六甲基二硅胺烷(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、N，O-双三甲基硅烷基乙酰胺(BSA)、N，N-二甲基酰胺、吡啶、环己烷均为分析纯。 D-半乳糖、D-核糖、D-木糖、D-果糖、DL-阿拉伯糖、葡萄糖、肌醇均为生化试剂。 1.2色谱条件 色谱柱为SE-30毛细管色谱柱：25m×0.23(ID)x0.1 um(film)； 检测器为氢火焰离子化检测器(FID)；汽化室温度为250℃，柱温为230℃，检测器温度为250℃；载气为氮气，总流速为 9.6 ml/min，柱流速0.6 ml/min，H2流速为47.0 ml/min， 空气速速为4400ml/min，进样量0.8p1， 分流比 10：1。肌醇为内标物。 1.3试样来源及预处理 所用苦丁茶样品，购自于大连开发区大商新玛特商场。首先将试样于80℃烘箱中烘干，然后用微型植物试样粉碎机粉碎，置于棕色广口瓶中保存。 1.3.1单糖标准溶液的制备 标准溶液的配制：准确称取D-半乳糖、D-核糖、D-木糖、D-果糖、DL-阿拉伯糖、葡萄糖、肌醇各 300 mg， 溶解后，转移于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 另准确称取肌醇300 mg 于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，得肌醇标准溶液。 浓缩干燥：用移液管准确移取上述标准溶液2ml于烧瓶中，于80℃水浴中用旋转蒸发仪蒸发至近干，移至试管中，在80℃水浴中用冷风吹至干。 溶解：试管中加人2ml二甲基亚砜(DMSO)，超声波中振荡 15 min， 使之溶解。 衍生化：在试管中加入3ml衍生化试剂(HMDS：TMCS=2：1，v/v)，进行衍生化。 萃取：在上述试管中在加人2ml环己烷萃取，摇匀，静置分层，取上清液供汽相色谱分析。 1.3.2样品的制备 试样单糖的提取：准确称取已粉碎的苦丁茶样品 2.00 g于100ml三角瓶中，同时加入肌醇标准溶液2ml作为内标物，再加入100ml沸水，于80℃恒温水浴中提取5h， 过滤。 浓缩干燥：将滤液转移至烧杯中，于80℃水浴中用旋转蒸发仪蒸发至近干，移至试管中，在80℃水浴中用冷风吹至干。 其他步骤同1.3.1中的溶解、衍生化、萃取处理步骤。 2结果与讨论 2.1衍生化方法的选择 将单糖通过衍生化反应，转化为三甲基硅醚衍生物，然后采用气相色谱进行分析。本文通过改变溶剂及衍生化试剂，以选择出最佳的三甲基硅烷化衍生化方法。第一种方法采用(六甲基二硅胺烷 )HMDS 与(三甲基氯硅烷)TMCS 作为衍生化试剂，以(二甲基亚砜)DMSO 为溶剂；第二种方法同第一种方法用 HMDS 与 TMCS 作为衍生化试剂，但采用二甲基甲酰胺作溶剂；第三种方法，用吡啶作溶剂；第四种方法用吡啶作溶剂，以 N，O-双三甲基硅烷基乙酰胺(BSA)作衍生化试剂。上述四种方法列入表1。 试验中发现，由于 HMDS 与 TMCS易于水解，所以在衍生化前要除去水，所以方法Ⅰ、Ⅱ先将样品干燥、除水，然后再进行衍生化反应；方法Ⅱ所用溶剂二甲基甲酰胺的溶解能力不及二甲基亚砜；第Ⅲ种方法溶剂 为吡啶，在衍生化过程中会产生沉淀。加人少量蒸馏水会使沉淀溶解，但仅能维持很短的时间，随之又有沉淀出现；第Ⅳ种方法采用 BSA 作衍生化试剂，样品可不经干燥直接衍生化，反应速度较快，但效果较差。所以选择方法Ⅰ作为苦丁茶样品的最佳衍生化方法。 2.2苦丁茶中单糖组成 苦丁茶可溶性单糖色谱分析结果见图 1。 表1四种衍生化方法 Table 1 Four kinds of Derivative Methods 方法 溶剂 衍生化试剂 萃取剂 除沉淀 Method Solvent Derivative Solvent Extraction Solvent Removing the precipitation DMSO2 ml HMDS 2 ml+TMCS1ml 环己烷 — 二甲基甲酰胺 3 ml HMDS 2 ml+TMCS l ml 环己烷 吡啶 2 ml HMDS 2mL+TMCS 1 ml 水 Ⅳ 吡啶2 ml BSA6ml — 图1苦丁茶单糖气相色谱图 Fig. 1 Chromatogram of Monosaccharides in Zlex Lalifotia Thumb 注：1：阿拉伯糖；2：核糖；3：木糖；4：果糖；5、7：半乳糖；6、8：葡萄糖；9：肌醇 Note：1： arabinose； 2：ribose ； 3： xylose ； 4： fructose ； 5、7： galactose； 6、8：glucose；9： myoinositol. 糖本身没有足够的挥发性，在气相色谱分析之前必须预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。由于糖的异构化，在衍生化制备过程中，易产生衍生物的异构体I6.7]，为此，一种单糖得到的往往不是一个色谱峰，由图1可见。 单糖的定性是用各种单糖，即阿拉伯糖、核糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、肌醇的标准样品衍生化后，用气相色谱分别测定每种单糖的色谱峰，由此确定苦丁茶样品中各种单糖色谱峰的个数和保留时间。各种单糖含量的定量计算，是用内标法计算，本文以肌醇为内 标物。由此检测出苦丁茶中的单糖有半乳糖、核糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、葡萄糖。计算的各种单糖含量见表2。由表2可以看出，半乳糖含量最高，果糖与葡萄糖次之，阿拉伯糖含量最少。 2.3精密度实验 为了检验方法的重复性，进行了精密度实验。对苦丁茶样品进行了10次测定，结果见表2。由表2可见，各种单糖含量的相对标准偏差在1.5%~7.9%，符合相对标准偏差小于10%的要求，说明本方法的重复性好。 表2相对标准偏差实验结果(n=10) Table 2 Result of the relative standard deviations (n=10) 单糖Monosaccharide 平均值(%) Average value 相对标准偏差(%) RSD 阿拉伯糖 Arabinose 0.006 7.9 核糖 Ribose 0.035 4.8 木糖Xylose 0.015 6.7 果糖 Fructose 0.440 4.2 半乳糖 Galactose 4.000 1.5 葡萄糖 Glucose 0.355 3.2 3结论 本文通过对衍生化方法的选择，确立了以二甲基亚砜(DMSO)作溶剂，六甲基二硅胺烷(HMDS)和三甲基氯硅烷(TMCS)作硅烷化试剂的衍生化方法，用S-E30 毛细管柱测定了苦丁茶中可溶性单糖的组成及含量。具有快速、重现性好等特点。检测出苦丁茶中含有半乳糖、核糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、葡萄糖，其中半乳糖含量最高，果糖与葡萄糖次之，阿拉伯糖含量最少。 ( 参考文献： ) ( [1] 尹礼国，张伟敏，钟耕.苦丁茶的生理功能与药用价值 ) ( [J].农产品加工，2005(1)：6~7. ) ( [2] 童小麟，唐明德.苦丁茶化学成分分析[J].茶叶通讯， 1996(1)：32~33. ) ( [3] 牟利辉.苦丁茶中熊果酸的提取及含量测定研究[].广 东化工，2005(3)：49~50. ) ( [4] 张鲁勉.苦丁茶的微量元素测定及其保健功能初探[J]. 广东微量元素科学，2002，9(8)：55~56. ) ( [5] 罗大英，朱冬雪，杨远庆.贵州苦丁茶新梢中可溶性糖含量变化分析[].山地农业生物学报，2003，22(3)： 230~232. ) ( [6] 张惟杰.糖复合物生化研究技术(第二版)[M].杭州：浙江大学出版社，1999：36~37. ) ( [7] 李元宗，常文保.生化分析(第一版)[M]. 北京：高等教育 出版社，2003：244~245. )