化橘红中化橘红多糖检测方案(气相色谱仪)

Vol 16No. ~~2Apr 1998第16卷第~~2期1998年4月广 东 医 学 院 学 报JOURNALOF GUANGDONGM ED ICAL COLLEGE15 广 东 医 学 院 学 报1998年第16卷16 化橘红多糖的分离纯化及其组成的气相色谱分析 程荷凤 蔡 春 李小凤(广东医学院化学教研室，湛江524023 2广东医学院中心实验室) 摘要 目的：从化橘红中提取分离多糖，并对其化学组成进行研究。方法：化橘红经醚提醇提后的药渣用热水提取，乙醇沉淀， Sevag 试剂脱蛋白，CTAB(溴化十六烷基三甲胺)络合法分离纯化；用气相色谱法对其组成进行研究。结果：分离得到的水溶性多糖经 Sephadex G-200 凝胶柱层析，硫酸-酚法证实为单一多糖，紫外光谱显示不含蛋白和核酸类物质。化橘红多糖是由D-木糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖和一个未知物(待定)组成。结论：化橘红多糖为杂多糖，气相色谱法是该多糖组成分析的简便易行的方法。 关键词 化橘红；多糖；分离纯化；组成；气相色谱 中图分类号 R931.6 Stud ies on isolation and com position of polysacchar ide of Exoca rp ium citri grandis by GC Cheng H efeng，Cai Chun，L i X iaofeng Departm ent of Chem isty， Guangdong M edical College，Zhanjiang 524023) AbstractObjective： To study the iso lation and compo sition of po ly saccharide of Exocarp ium citri grandis(ECG). Meth-ods： ECG was extracted by bo iling water The polysaccharide in the filtrate w as p recip itated fractionally by alcohol Thep ro tein in the p roduct was removed by Sevag reagent， and was further purified by CTAB. A fter hydro lysates of ECGpo lysaccharide was inverted into aldononitriles acetylate derivatives， the compositions were exam ined by means of GC.Results： The w ater so luble po lysaccharide obtained in this w ay didn’t contain p ro tein and nucleic acid in it It show ed asingle polysaccharide when identified by means of Sephadex G-200 co lum n. It was compo sed of D-xylo se，D-gluco se，D-calacto se，L -arabino se，D m anno se and an unkow n component Conclusion： ECG is a heteropo lysaccharide Thism ethod isa sip le and feasible w ay to analyze the compo sition of ECG polysaccharide Key words： Ex ocarp ium citri g rand is； po lysaccharide ； iso lation purification； compo sition； GC. 化橘红(Exocarp ium citri grandis，ECG) 为芸香料植物化州柚(Citrus g rand is T am en tosa')或柚(Cit-rus grandis (L.)0sbeck)的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，是我国传统的名贵中药材。药理试验证明ECG多糖有明显的祛痰止咳作用，临床疗效观察还发现ECG 多糖对慢性支气管炎、慢性阻塞性肺气肿具有良好疗效，未见毒副作用2。有关ECG多糖的药理及临床试验多以其粗制品进行的，而对于ECG 多糖的分离纯化及其组成方面的研究尚未见报道。本文对ECG多糖作了提取及分离纯化并对其组成进行了气相色谱研究，现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 ECG购自湛江市药材公司，并经生药学鉴定为Exocarp ium citri grandis.单糖标准品L-阿拉伯糖为 Sigm a 产品，D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖及其它试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器 气相色谱仪为日本岛津公司产品， GC-17A 型；UV-VISNR扫描分光光度计为日本岛津公司产品，UV-3101pc 型。 1.3 方法 1.3.1 多糖的提取与分离纯化 取 ECG粉碎后依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质，体积分数为80%乙醇提取除去单糖、低聚糖及甙类等干扰成分。药渣挥去溶剂后再用热水提取3次，每次4h，合并水提液，离心分离，上清液在70℃水浴减压浓缩至粘稠状，加入5倍量体积分数为95%乙醇醇析，静置过夜。过滤，沉淀物依次经无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空冷冻干燥得ECG多糖粗制品。 将粗多糖溶于蒸馏水，去不溶物，用 Sevag 试剂脱蛋白，重复6次以上，至紫外280mm 处无蛋白吸收。分离上清液以氨水调节pH=8，滴加过氧化氢，50℃保温脱色，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，过滤，沉淀物 依次经无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤2次，冷冻干燥得ECG 多糖半精品。将半精品再溶于热水，去不溶物，滤液用00577 mol/L 溴化十六烷基三甲胺(CTAB)络合精制3，获得ECG 多糖精制品，供分析鉴定用。 1.3.2 多糖纯度鉴定 凝胶柱层析：水溶性多糖经Sephadex G-200 柱层析，用005 mol/L NaC1平衡，流速5~6mL/h，上样量10 mg， 分部收集每份3mL，硫酚-苯酚法显色检测，根据分部收集中出现的峰数和形状断定多糖的纯度。 紫外光谱：将多糖溶于水配成 160 mg/L 溶液，观察在紫外区260mm 和280mm处特征吸收情况。 1.3.3 多糖组成的气相色谱分析 糖腈乙酸酯衍生物的制备4：将30mg ECG 多糖样品加入到有2mL2mol/L硫酸的水解管中，用氮气除氧封管，100℃水浴加热水解10 h，50℃水浴用饱和氢氧化钡溶液中和，高速离心除去沉淀，上清液在80℃下浓缩至干，置于干燥器内过夜。加入10mg盐酸羟胺和05mL吡啶，塞紧反应瓶口，90℃水浴反应40 m in， 摇匀。冷却至室温后加入1mL醋酸酐，90℃水浴继续反应40min 进行乙酰化。。2之后于50℃旋转浓缩除去溶剂至干，滴入05mL 氯仿溶解后即可取样进行气相色谱分析。 单糖标准品按同法制备糖腈乙酸酯衍生物。 气相色谱分析条件：色谱柱为DB-1交联石英毛细管柱30m ×0.25mm(J&W公司)，检测器FD，进25℃/min样口温度250℃，柱温100℃(1m in) -260℃(3min)， 载气为高纯氦，流速19. 50mL/m in， 分流比10：1. 2 结 果 ECG 多糖的理化性质：多糖为灰白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙醇、正丁醇等有机溶剂。其水溶液呈粘稠状，在浓硫酸存在下与α萘酚作用，界面处呈紫色环；水解前与斐林试剂呈阴性反应，水解后与斐林试剂呈阳性反应，产生棕红色氧化亚铜沉淀；与酚浓硫酸反应后，其特征吸收峰为489mm。经络合精制后的多糖紫外扫描结果在260mm 和280mm处未见核酸和蛋白质特征吸收峰。 SephadexG-200 柱层析，用硫酸-酚法检测为单一对称峰，表示ECG 多糖为单一多糖。 按上述色谱条件，可获得ECG 多糖水解物之糖腈乙酸酯衍生物的总离子流色谱图。多糖中单糖组成采用在相同条件下对照单糖标准品的保留时间定性，各单糖组分的相对百分含量根据峰面积归一法计算。 气 相色谱分析表明：ECG水溶性多糖由D-木糖(618%)、D-葡萄糖(19.27%)、D-半乳糖(2207%)、L-阿拉伯糖(17.08%)、D-甘露糖(11.11%)和一个未知物(待定)组成。组成中不含蛋白质和核酸类物质。结果见表1. 表1 ECG 多糖气相色谱分析结果(t/min) 峰号 单糖名称 标准品 样品水解物 TR1 TR1 2 D-木糖D-Xylo se) 7.675 7.680 3 D-葡萄糖(D-Gluco se) 7.767 7.742 4 D-半乳糖D-Calacto se) 7.867 7.892 5 L-阿可伯糖(L-A rabinose) 8450 8500 6 D-甘露糖(DM anno se) 8750 8717 待定 6633 3 讨 论 在多糖的纸色谱研究中，由于D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖的Rr值相近往往难以完全分离，而在本实验气相色谱条件下却可以得到完全分离，每种糖都能得到单一的色谱峰。由此可见，本文建立的气相色谱分析法用于中草药中多糖组成的分析，效果较为满意. 近年来多糖的研究越来越多，尤其是对具有免疫增强作用的各种多糖的研究愈来愈受到人人的重视，并不断向价廉易得的原料方面发展。作者首次对ECG多糖的分离纯化及其组成进行了研究，这不仅对开发利用本地区资源有一定的意义，而且还可以指导提高化橘红多糖等药物的质量。 ECG多糖的化学结构以及生物活性有待进一步研究。 ( 4 参考文献 ) ( 1 中华人民共和国卫生部药典委员会编中国药典(一部).广 州：广东科技出版社，1995.54 ) ( 2 周博文，胡稚文，吴俊景化州橘红多糖的药用研究中国药 学杂志，1993，28(4)：135 ) ( 3 吴梧桐，陈琼华，徐碧如银耳孢子多糖的分离和分析真菌 学报，1982，1(2)： 1 19 ) ( 4 张惟杰主编复合多糖生化研究技术上海：上海科学技术 出版社，1987.41~43 ) ( 5 张憔杰主编复合多糖生化研究技术上海：上海科学技术 出版社，1987. 1 09~110 ) ( (收稿日期：1997-11-04) ) O China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net