鱼肉中有机汞形态检测方案(原子荧光光谱)

食品研究与开发Food Research And Development2014年11月第35卷第21期检测分析 肖亚兵，等：液相色谱-原子荧光法测定鱼肉中有机汞形态检测分析107— 液相色谱-原子荧光法测定鱼肉中有机汞形态 肖亚兵，崔颖，陈文硕，姚梦楠? (1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.北京海光仪器有限公司，北京100016) 摘 要：建立微波辅助萃取-液相色谱-原子荧光(MAE-LC-AFS)测定鱼肉中甲基汞和乙基汞的分析方法。优化了液相色谱流动相、微博辅助萃取技术的提取剂浓度和萃取温度。在0~50 ug/L 范围内甲基汞和乙基汞的线性关系良好，线性相关系数大于0.999，甲基汞和乙基汞检出限(S/N=3)分别为0.07、0.13 pg/L。3种样品在0.25、0.5、1.0 mg/kg 3个加标水平下的平均回收率为甲基汞80.3%~91.4%，乙基汞72.2%~83.3%，相对标准偏差(RSD)分别为2.4%~5.8%、2.3%~5.5%。该法适用于鱼肉中甲基汞和乙基汞的测定。 关键词：液相色谱-原子荧光；微波辅助萃取；甲基汞；乙基汞 Determination of Organic Mercury Speciation in Fish by LC-AFS XIAO Ya-bing'，CUI Ying?， CHEN Wen-shuo， YAO Meng-nan’ (1. Tianjin Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau， Tianjin 300461， China； 2. Beijing HaiguangInstrument Co.， Ltd.，Beijing 100016， China) Abstract： A method for simultaneous determination of methylmercury (MeHg) and ethylmercury (EtHg) in fishwas developed by Microwave-Assisted Extraction-Liquid Chromatography-Atomic Fluorescence Spectrometry(MAE -LC -AFS). Optimized the mobile phase， microwave -assisted extraction conditions， namely theconcentration of the extraction solvent， the extraction temperature. Under the optimal conditions， the calibrationcurves for MeHg and EtHg were linear over the concentration ranges of0- 50 ug/L and their correlationcoefficients were 0.999 1-0.999 7.The detection limits of MeHg and EtHg were 0.07 and 0.13 ug/Lrespectively.The average recoveries of MeHg and EtHg from three samples spiked at three levels of 0.25，0.5， 1.0 mg/kgwere range of 80.3 %-91.4 % and 72.2%-83.3 % with RSDs of 2.4 %-5.8 % and 2.3 %-5.5 % ， respectively.This method is feasible for analysis of MeHg and EtHg in fish. Key words： Liquid chromatography -Atomic fluorescence spectrometry； microwave-assisted extraction；methylmercury； ethylmercury 汞是一种剧毒物质，主要包括元素汞、无机汞和有机汞。元素汞基本无毒，有机汞中的苯基汞分解较快，毒性不大，甲基汞进入人体很容易被吸收，不易降解，排泄很慢，特别是容易在脑中积累，毒性最大。水体中的汞很容易被水生生物吸收，从而引起鱼肉中汞含量的增加，汞在鱼体内转化为甲基汞。因此即使在甲基汞含量低的水中，也会导致鱼肉甲基汞污染，据报道，鱼肉中甲基汞的含量占总汞的72%~100%"。我国国家标准规定了水产动物及其制品(肉食性鱼类及 ( 基金项目：天津出入境检验检疫局项目 (TK077-2013) ) ( 作者简介：肖亚兵(1974一)，男(汉)，高级工程师，研究生，研究方向：食品元素及其形态分析。 ) 其制品除外)中甲基甲限量指标为0.50 mg/kg，肉食性鱼类及其制品中甲基汞限量指标为 1.0 mg/kg2。因此，为了保证鱼肉食品的安全，应建立相对应的检测方法。 目前关于甲基汞和乙基汞形态的检测方法主要是色谱分离与检测器的联用技术。如气相色谱 (ECD)法3-41，该法操作步骤较为繁琐，试剂用量大，并且有的试剂毒性很大，对操作者的身体健康造成危害。报道较多的是液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS) I5-7和液相色谱-原子荧光(LC-AFS) 18-10联用技术。LC-ICP-MS 法灵敏度高，各形态分离效果好，但由于其价格昂贵，运行和维护成本高，目前很难普及，而且液相色谱的流动相中通常会含有一定比例的有机溶 剂，有机溶剂在 ICP 中所产生的白可造成 ICP-MS的进样管堵塞和采样锥、截取锥两锥孔变得越来越小甚至堵塞，从而导致 ICP-MS 的信号不稳定"。液相色谱-原子荧光联用仪是我国拥有自主知识产权的分析仪器，该仪器具有结构简单，易操作，分析成本低，选择性好等优点。另外，微波辅助萃取具有萃取效率高、重现性好、节省时间和试剂、污染小等特点。而且在微波辅助萃取过程中，碳-金属元素键不会遭到破坏，因而特别适用于元素有机形态的前处理2-131。因此本实验研究并建立了微波辅助萃取-液相色谱-原子荧光(MAE-LC-AFS)测定鱼肉中甲基汞和乙基汞的分析方法。 1材料与方法 1.1 仪器与试剂 LC-AFS9800 液相色谱-原子荧光联用仪：北京海光仪器公司；Explorer48 微波辅助萃取仪：美国 CEM公司；LD4-2型离心机：北京医用离心机厂；涡旋混合器：美国Fisher公司；超纯水仪、0.45um 滤膜：美国Millipore公司；反相C18色谱柱：150 mmx4.60 mm，5um，美国 Agilent 公司。 甲醇(色谱纯)；盐酸(优级纯)；乙酸胺、半胱氨酸、氯化钠、氢氧化钾、硼氢化钾、过硫酸钾(分析纯)；还原剂(0.5%氢氧化钾+0.5%硼氢化钾)：称取氢氧化钾5g，硼氢化钾5 g溶于水中，并稀释至1000mL混匀；氧化剂(0.5%氢氧化钾+1%过硫酸钾)：称取氢氧化钾5g，过硫酸钾10 g 溶于水中，并稀释至1000 mL混匀；流动相(5%甲醇+0.462%乙酸铵+0.12%L-半胱氨酸)：量取甲醇25 mL，称取乙酸铵 2.31 g、L-半胱氨酸 0.60 g溶于水中，并稀释至500 mL混习；微波萃取剂(5%盐酸+0.15%氯化钠)：量取盐酸 50 mL，称取氯化钠1.5 g溶于水中，并稀释至1000 mL昆匀；氯化甲基汞和氯化乙基汞标准溶液 (Merck 公司)：均为溶于甲醇的1000 mg/L 的存储液，存储液在4℃冰箱中用棕色瓶保存，实验中所需标准工作溶液均由上述存储液逐级稀释；鱼肉中总汞与甲基汞成分分析标准物质(GBW10029，国家标准物质中心)；实验用水为超纯水。 小黄鱼、金枪鱼、三文鱼：进口送检样品。 1.2 液相色谱及 AFS 条件 LC 条件：色谱柱：C18柱(150 mmx4.60 mm，5 pum)；流速：1.0mL/min；进样量：100pL；流动相：5%甲醇(色谱纯) +0.462%乙酸铵+0.12%L-半胱氨酸。 原子荧光工作条件：总电流：30mA；负高压：280V； 载气流速：600mL/min；屏蔽气流速：1000mL/min。 1.3 样品前处理 将鱼肉样品绞碎后，称取1.0g(精确到0.01g)试样于35mL微波萃取管中，加10 mL微波萃取剂(5%盐酸+0.15%氯化钠)，放人磁力搅拌棒预搅拌2 min，60℃密闭式微波提取 20 min， 15 000 r/min 离心 5 min，将上清液转移至25 mL 容量瓶中。向残渣中再加入微波萃取剂(5%盐酸+0.15%氯化钠)10mL，重复上述提取步骤，合并上清液于25 mL 容量瓶中，定容。此溶液过0.45 p.m 滤膜后，供液相色谱-原子荧光光谱测定。 2 结果与讨论 2.1 流动相的优化 实验以甲醇为流动相，选用乙酸铵来调节 pH，半胱氨酸作为络合剂与汞化合物形成络合物，从而在色谱柱上分离，所以半胱氨酸含量对分离效果影响较大。流动相中的甲醇影响汞化合物的出峰时间，改变流动相中甲醇的含量使出峰时间最佳。 通过实验比较，选择的流动相为5%甲醇+0.462%乙酸铵+0.12%半胱氨酸(甲基汞、乙基汞混合标准溶液谱图见图1)。 图1 甲基汞和乙基汞混合标准溶液谱图(20pg/L) Fig.1 LC-AFS chromatograms of mixed standard solution ofMeHg and EtHg (20 pg/L) 2.2 微波辅助萃取条件优化 2.2.1 盐酸浓度优化 目前有机汞主要是通过酸提取，酸浓度对有机汞提取效率的影响较大。本实验比较了1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的盐酸和0.15%氯化钠混合溶液作为提取剂，60℃条件下，微波萃取 10 min，计算回收率。结果表明：当盐酸浓度在5%~7%时，甲基汞的回收率在80%以上，乙基汞的回收率在70%以上。因此，最终选择5%作为盐酸的最佳浓度。 2.2.2温度条件优化 温度是影响微波萃取效率的重要因素。本实验以 5%的盐酸和0.15%氯化钠混合溶液作为提取剂，分别在40、50、60、70℃和80℃条件下进行微波辅助萃取，计算回收率。结果表明，甲基汞的回收率在60℃时最高，但随着温度升高回收率有所下降；萃取温度对乙基汞的回收率影响较小。综合考虑甲基汞和乙基汞的回收率，最终选择60℃作为萃取最佳温度。 2.3 检出限、线性范围及线性关系 在最佳实验测定条件下，取一系列不同浓度的甲基汞和乙基汞混合标准溶液进行线性回归实验，结果表明：当甲基汞和乙基汞的浓度在0~50 pg/L 范围时，线性关系良好，其相关系数、回归方程和检出限分别为：甲基汞r=0.999 1，Y=7.204 4X-8.9812，检出限为0.07 pg/L；乙基汞 r=0.999 7，Y=1.853 2X-4.3123，检出限为0.13 ug/L。 2.4 样品分析 按照实验方法对鱼肉标准物质(GBW10029，国家标准物质中心进行6次平行测定，平均值为 0.81mg/kg，RSD 为 3.51%，与标准值(0.84±0.03) mg/kg 相符。 另取小黄鱼、金枪鱼、三文鱼等3种样品进行不同添加水平的回收率测定，结果见表1。 表1 样品中甲基汞和乙基汞的加标回收率(n=6) Table 1 Recoveries of Methylmercury and ethylmercury in fish(n=6) 样品 添加量/ 甲基汞 乙基汞 测得量/ 回收 测得量/ 回收 (mg/kg) RSD/% RSD/% (mg/kg) 率/% (mg/kg) 率/% 小黄鱼 0.25 0.22 88.2 5.8 0.18 72.2 4.1 0.5 0.43 86.1 3.2 0.39 78.0 2.3 1.0 0.88 88.1 2.4 0.83 83.3 2.5 金枪鱼 0.25 0.21 84.0 4.5 0.19 76.2 4.1 0.5 0.44 88.1 5.6 0.40 80.0 5.5 1.0 0.91 91.4 0.82 82.4 3.2 三文鱼 0.25 0.20 80.3 0.20 80.1 3.8 0.5 0.42 84.0 0.38 76.3 4.6 1.0 0.83 83.2 2.6 0.79 79.0 3.4 从表1中可看出，甲基汞的平均回收率为80.3%~91.4%，相对标准偏差(RSD)为2.4%~5.8%；乙基汞的平均回收率为72.2%~83.3%，相对标准偏差(RSD)为2.3%~5.5%。由此可见，在选定的实验条件下本方法具有良好的回收率。 3 结论 本文采用微波辅助萃取 (MAE) 前处理方法，液相色谱-原子荧光(LC-AFS) 联用技术测定了鱼肉中的甲基汞和乙基汞。本方法具有操作简单，运行成本低，精密度高，结果可靠等优点，适合于鱼肉中甲基汞和乙基汞的测定。 ( 参考文献： ) ( [1 ] John E G， Peter M T ， E l izabeth A B . 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