食品营养强化剂中乳铁蛋白检测方案(制备液相色谱)

GB1903.17—2016 中华人民共和国国家标准 GB31903.17—2016 食品安全国家标准食品营养强化剂 乳铁蛋白 2016-12-23发布 2017-06-23实施 食品安全国家标准食品营养强化剂 乳铁蛋白 1 范围 本标准适用于以乳及乳制品为原料，经分离、杀菌、提取、精制、x燥制得的食品营养强化剂乳铁蛋白。 2 技术要求 2.1 感官要求 感官要求应符合表1的规定。 表1 感官要求 项 目 要 求 检验方法 色泽 粉红色至红褐色 取适量试样置于清洁、干燥的无色玻璃烧杯中，在自然 光线下，观察其色泽和状态 状态 粉末 2.2 理化指标 理化指标应符合表2的规定。 表2：理化指标 项 目 指 标 检验方法 总蛋白，w/% ≥ 93.0 GB 5009.5 乳铁蛋白占总蛋白质量百分比，w/% ≥ 95.0 附录A中A.2 干燥减量，w/% 4.5 GB 5009.3直接干燥法b 灰分，w/% 2.0 GB 5009.4 铁含量/(mg/100 g) 35 GB 5009.90 溶解度 通过试验 附录A中A.3 pH 5.2~7.2 GB/T 9724 铅(Pb)/(mg/kg) 1.0 GB 5009.75或 GB 5009.12 砷(As)/(mg/kg) 1.0 GB5009.76 a氮换算为蛋白质的系数为6.38。 b干燥温度和时间分别为105℃±2℃和5h。 20℃下测定20 g/L水溶液。 2.3 微生物限量 微生物限量应符合表3的规定。 表3 微生物限量 项 目 限 量 检验方法 菌落总数/(CFU/g) ≤ 1000 GB 4789.2 霉菌和酵母菌/(CFU/g) ≤ 10 GB 4789.15 大肠菌群/(MPN/g) < 3.0 GB 4789.3 MPN计数法 沙门氏菌/25g 不得检出 GB 4789.4 金黄色葡萄球菌/25g 不得检出 GB 4789.10定性检验 附 录 A 检验方法 A.1 一般规定 本标准除另有规定外，所用试剂的纯度均为分析纯，所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，应按 GB/T601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备，试验用水应符合 GB/T 6682 中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。 A.2 乳铁蛋白占总蛋白质量百分比的测定 A.2.1 方法提要 采用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，于紫外检测器 280 nm 处通过色谱柱分离测定乳铁蛋白，面积归一化法定量。 A.2.2 试剂和材料 A.2.2.1 水：符合 GB/T 6682的一级水。 A.2.2.2 乙腈：色谱纯。 A.2.2.3 氯化钠溶液：0.9%。 A.2.2.4 1%三氟乙酸溶液：吸取1mL三氟乙酸，加一级水定容至100 mL，过0.45 _m 滤膜。 A.2.2.5 乳铁蛋白对照品：纯度≥95%. A.2.2.6 0.45 um 微孔水相滤膜。 A.2.3 仪器和设备 高效液相色谱仪：配备紫外检测器。 A.2.4 参考色谱条件 A.2.4.1 色谱柱： Alltech prosphere C4 300A(150 mm×4.6 mm)， Alltech All-guardTM Guard(7.5mm ×4.6mm)或具有同等性能的色谱柱。 A.2.4.2 检测波长：280 nm。 A.2.4.3 流速：1.0 mL/min。 A.2.4.4 柱温：35℃。 A.2.4.5 进样量：50uL。 A.2.4.6 流动相梯度洗脱参数见表 A.1。 表A.1 流动相梯度洗脱程序表 时间/min ·级水/% 乙腈/% 三氟乙酸溶液/% 0.00 73.3 16.7 10 10.00 35 55 10 11.00 18 72 10 13.00 18 72 10 15.00 73.3 16.7 10 A.2.5 分析步骤 称取试样和乳铁蛋白对照品各 0.1 g，分别加入一级水(或氯化钠溶液)10 mL 使其溶解后，通过0.45 um 滤膜，得到试样溶液和对照溶液。分别量取上述两种溶液50 uL 注入高效液相色谱仪，在280 nm 处进行测定，使试样溶液主峰的保留时间和对照溶液主峰的保留时间相一致(约为10 min)。主峰作为乳铁蛋白峰，在主峰保留时间2倍范围内测定所有溶出的峰面积，主峰面积与所有峰面积的比值即为总蛋白中乳铁蛋白的含量。 A.2.6 结果计算 乳铁蛋白占总蛋白含量的质量分数wi，按式(A.1)计算： 式中： A；——-主峰的峰面积； A 所有溶出的峰面积。 试验结果以平行测定结果的算术平均值为准，保留3位有效数字。 A.3 溶解度试验 A3.1 分析步骤 称取0.8g试样，加入约40 mL 的20℃水中，充分搅拌2 min 以上，静止后观察。此时试样应完全溶解，溶液澄清透明，无肉眼可见杂质。 附 录 乳铁蛋白对照品参考色谱图 乳铁蛋白对照品参考色谱图见图B.1。 300 图B.1 乳铁蛋白对照品参考色谱图 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品!监督管理总局发布 检 验 方 法A. 1  一般规定本标准除另有规定外,所用试剂的纯度均为分析纯,所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品,应按 GB / T601 、 GB / T602 、 GB / T603 的规定制备,试验用水应符合 GB / T6682 中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。A. 2  乳铁蛋白占总蛋白质量百分比的测定A. 2. 1  方法提要采用高效液相色谱法,在选定的工作条件下,于紫外检测器 280nm 处通过色谱柱分离测定乳铁蛋白,面积归一化法定量。A. 2. 2  试剂和材料A. 2. 2. 1  水:符合 GB / T6682 的一级水。A. 2. 2. 2  乙腈:色谱纯。A. 2. 2. 3  氯化钠溶液: 0. 9% 。A. 2. 2. 4 1% 三氟乙酸溶液:吸取 1mL 三氟乙酸,加一级水定容至 100mL ,过 0. 45 μ m 滤膜。A. 2. 2. 5  乳铁蛋白对照品:纯度 ≥95% 。A. 2. 2. 6 0. 45 μ m 微孔水相滤膜。A. 2. 3  仪器和设备高效液相色谱仪:配备紫外检测器。A. 2. 4  参考色谱条件A. 2. 4.1  色 谱柱: AlltechprosphereC4300A ( 150 mm×4.6 mm ), Alltech All-guardTM Guard(7. 5mm ×4. 6mm )或具有同等性能的色谱柱。A. 2. 4. 2  检测波长: 280nm 。A. 2. 4. 3  流速: 1. 0mL / min 。A. 2. 4. 4  柱温: 35℃ 。A. 2. 4. 5  进样量: 50 μ L 。A. 2. 4. 6  流动相梯度洗脱参数见表 A. 1 。