微纳颗粒、细胞、细胞器中细胞运动与力学检测方案(光学镊子)

多光阱捕获技术与细胞力的测量 一.力与捕获稳固度校正 珠子捕获的几何学特征 A)和B)光阱捕获的直径4.5 pm 聚苯乙烯珠以任意几何图案排布C)具有不同捕获强度的珠子被独立地移动通过样品品D)37℃下C中具有不同捕获强度的珠子的热力学运动轨迹 2.200mW最高可用激光能量下的捕获强度与捕获力间关系(基于胡克定律) Bead size K[pN/nm Fmax [pN] 3.0 um 0.10±0.01 120±15 4.5 um 0.16 ±0.02 190 ±20 二.实验过程 力：光谱学和逆向流试验 纤连蛋白包被的珠子被放置到在纤连蛋白功能化玻璃基质上铺展开的细胞上A)珠子被捕获并被放到前导端的膜顶点。在力的光谱学试验中，光阱捕获的珠子通过施加一个与细胞牵引力相反的力来移动B)珠子上的细胞牵引力使得珠子从光势阱底部移开。随着与平衡位置XO的距离增加，光阱对珠子施加的回复力线性增加C)在逆向流试验中，珠子被捕获并被放到前导端的膜上并暂停对珠子的捕获。与退行肌动蛋白偶联的珠子展示了一个向着核方向的逆向运动。 三. 结果 1. 牵引力与珠子尺寸的关系 Contact time (s) A)前导端被放置珠子的一个MEF野生型细胞的DIC图像 T箭头指示细胞牵引力的方向(标尺=10 um). B)珠子与细胞膜间有效接触面积。珠子轻微陷入膜中，整合蛋白结合在膜-珠表面。C)3.0um and 4.5 um直径珠子的力强度与接触时间曲线，-一系列实验的平均值(n3.0pm=17 and n4.5um=14) 2. 配合基密度介导的粘附强度 C Contact time (s) B D 由不同密度度配合基纤连蛋白和RGD多肽包被的珠子A)不同密度配合基功能化的纤连蛋白珠子上的牵引力 B)FN包被珠子的牵引力对表面覆盖度关系图 (mean±SEM).C) 除了完全被单分子层包被的珠子(100%)外，还准备了由双分子层包被的珠子(150%)。珠子上的力出现饱和效应 D)FN和RGD多肽包被珠子的力的比较(mean ± SEM， 线上的数字为实验细胞的个数) 3. MEF野生型细胞的力和逆运输速率 A)和B)细胞表面分布4.5 pm直径FN功能化珠子的MEF野生型细胞的DIC图.矢量代表了A)牵引力 B) 逆向运输及其力和速率的大小。赋色区域标记细胞轮廓，红线标记核轮廓(标尺=10um). C) 接触300秒后力随逆运输速率成比例的增加。插图展示了不同细胞区域的原理图解(柱状图： mean±SEM；横线上的数字代表实验中细胞的数目) 4. 鸡原代细胞前导端的逆运输速率 Distance from leading edge tip(pm) 鸡原代成纤维母细胞逆运输速率随距离前导端顶点距离的变化 5. 珠子空间分隔对力变化的影响 A)膜上紧密排布珠子的野生型MEF细胞。矢量表征一对平行方向珠子(黑色)的力的传输和垂直于前导端边缘的珠子(红色)(标尺=10 um).B)鬼笔环肽染色的MEF野生型细胞的肌动蛋白细胞骨架 C) 框区放大.肌动蛋白细胞骨架假定了一个经过向网络状结构转变的凝胶状片状伪足.D)中心距离d=5um or d>10um平行放置珠子在300秒时间跨度内的变化.E)接触300秒时间后平行于垂直定向的珠子力的比较(mean±SEM；横线上的数字=验数目). 6. B16，MEF野生型和PCF细胞中牵引力，逆向运输速率vrt 和迁移速率vm 。膜珠接触300秒后测得的力大小. Cell type Force [pN] Vrt [um/min] Vm [um/min] B16 42±2 0.097±0.006 0.53±0.03 MEF WT 81±7 0.17十0.02 0.45±0.02 PCF 155±10 0.44±0.03 0.27±0.03 7. B16， MEF 野生型和 PCF细胞的比较 所研究细胞类型的牵引力，逆向运输速率和细胞运动性表现出特征性的相关：运输速率与牵引力间存在线性相关。迁移速率与另外两项趋势相反。膜珠接触时间为300秒。 8. 野生型和 MEFvin(-/-) 细胞的逆向运输 A A)显示MEF野生型和MEFvin(-/-)细胞逆运输轨迹的标记区域的放大。MEF野生型细胞具有高度定向的向后的运输，而MEFvin(-/-) 细胞表现出对核方向的曲折运动B) MEFvin(-/-) 细胞中的逆运输被一个或两个因子加强，而方向的固定性被三个因素减弱 C) DIC与LSM荧光通道图像叠加展示在表达vinFL的MEF野生型细胞前导端放置的一个4.5um直径的纤连蛋白功能化珠子D)黏着斑蛋白-GFP定位得3D投影，展示了蛋白在珠子周边的环状聚集。红色箭头指出了膜珠界面(标尺=10 um). 9. 力变化与逆向运输流的多参数研究 纤连蛋白功能化珠子被放置在细胞的前导端A)极化细胞的肌动蛋白细胞骨架(绿色)粘附位点(蓝色)。片状伪足由分枝的凝胶状肌动蛋白网络组成，薄片的末梢区域特征为缀有肌浆球蛋白马达的伸缩性肌动蛋白丝网络A1)由不同珠子直径模拟的不同尺寸粘附位点的力的变化。A2) 珠子分布在整个前导端，细胞表现出位置依赖的力的变化A3)平行或垂直于膜端邻近粘附位点的力的变化B)迁移中细胞的侧面 B1)逆运输流的位置依赖性 10.野生型与黏着斑蛋白敲除细胞中牵引力与肌动蛋白动态比较 A)一个快速迁移的野生型细胞在个别粘附位点展现出弱的力和慢的逆向流速率B)慢速迁移的野生型细胞展现出强的粘附力和快的肌动蛋白动态C)黏着斑蛋白缺陷(vin(--))导致了增强的细胞迁移性，弱的粘附力和增强的逆向肌动蛋白流