土鳖虫微粉中游离氨基酸检测方案(制备液相色谱)

Agela Technologies博纳艾杰尔产品应用案例 土鳖虫微粉中游离氨基酸分析报告 AP10081 应用及技术服务部 摘要：本实验采用目前广泛使用的以OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐)为衍生剂的柱前衍生HPLC氨基酸分析方法，同时采用反相高效液相色谱法，以正缬氨酸为内标物，使用 DurashellAA 氨基酸分析方法包，分析土鳖虫微粉中游离氨基酸。本方法快速、灵敏、准确、无需要手工衍生，可全自动化在线分析、衍生试剂无毒、无臭等优点。 关键词：高效液相色谱法；OPA(邻苯二甲醛)； FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐)；土鳖虫微粉； DurashellAA；氨基酸 前言 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 本实验采用DurashellAA氨基酸分析方法包中的检测标准， 使用Durashell AA氨基酸分析专用柱对土鳖虫微粉中游离氨基酸进行测试。 实验部分 仪器、试剂与材料 试剂材料 流动相A：称取十二水合磷酸氢二钠7.2 g，-十水合四硼酸钠7.6 g， 加水2000mL，用盐酸(约3.0mL) 调节PH至8.2，用0.45um滤膜过滤； 流动相B：取甲醇450mL， 乙腈450mL， 水100mL，混匀，超声脱气； 稀盐酸：取36%盐酸4.16 mL， 加水稀释至500 mL； 衍生试剂(OPA)： 取 Durashell AA 氨基酸分析方法包中OPA-A试剂1支，加入 OPA-B 试剂 60uL，混匀，即得； 稀释剂：取100mL 流动相A，加磷酸0.5 mL，混匀； 混合氨基酸对照品：(L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、，甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、氯化铵、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-是色氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸浓度为 2.5 umol/mL， L-胱氨酸浓度为1.25 umol/mL)； 土鳖虫微粉：褐色粉末，由某药科大学提供。 样品制备 衍生用混合氨基酸标准溶液：准确量取氨基酸分析方法组件包中的氨基酸标准溶液100pL， 置于2mL样品瓶中，准确加入内标溶液50pL， 0.1 mol/L 盐酸溶液 400uL，混匀，作为衍生用混合氨基酸标准溶液； 衍生用土鳖虫微粉样品溶液：准确称取样品 0.5 g， 加乙腈/水=50/50(v/v) 25 mL，混匀，超声处理 30 min， 经0.45 um 针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液，准确量取样品溶液 500 uL， 置于2.0mL样品瓶中，准确加入内标溶液50 uL， 混匀，作为衍生用样品溶液。 色谱条件 色谱柱： Durashell AA； 3 pm； 4.6×150 mm； 柱 温：：45℃： 波 长：338 nm(22 min 切换波长为 262 nm)； 进样量：2uL； 衍生程序： DurashellAA 氨基酸分析方法包中氨基酸衍生程序； 梯 度： 表1.液相色谱梯度洗脱条件 时间/min A/% B/% 流速mL/min 0 95 5 1.6 6 90 10 1.6 8 90 10 1.6 10 84 16 1.2 23 58 42 1.2 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 25 33 67 1.6 28 0 100 1.6 31 0 100 1.6 32 95 5 1.6 35 95 5 1.6 结果与讨论 本实验采用 Durashell AA 氨基酸分析方法包对土鳖虫微粉中氨基酸进行了测试，由图2可知，使用 Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉中17种游离氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好。 图1.19种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图 按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。 图2.土鳖虫微粉样品溶液高效液相色谱图 按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。 结论 根据实验结果，使用Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉样品中 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 17种游离氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好，能够满足检测要求。 附：相关产品 产品名称 规格描述 包装数量 订货号 Durashell AA 氨基酸分析方法包 1 AA952505-K Durashell AA 氨基酸分析专用柱 4.6×250mm， 5 um 1 AA952505-0 1.5 mL样品瓶 短螺纹透明带书写处32×11.6mm 100/PK 1109-0519 1.5mL 样品瓶盖 9mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色 PTFE 隔垫45°Shore A； 1.0 mm 100/PK 0915-1819 散孔滤膜 单膜， 13 mm， 0.45 um 100个/包 AS021345-T 一次性注射器 2mL无针头 100支/包 LZSQ-2ML 甲醇 4L/瓶，色谱纯 4x4L/箱 AH230-4 ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w.ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：话： 传真：mail： service@agela.com.cn 网址： www.agela.com.cn 客服： 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：话： 传真：