乳糖辅料中半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖杂质检测方案(离子色谱仪)

thermoscientific 标准溶液的制备标准贮备溶液S CIENTIFIC 离子色谱-脉冲安培检测法测定乳糖辅料中有关物质 彭绪玲，潘广文，李仁勇赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 离子色谱法；脉冲安培检测；辅料； PA1色谱柱；糖类目的 建立离子色谱脉冲安培检测法测定辅料乳糖中半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖的方法，对辅料乳糖进行质量控制。 引言 乳糖是由半乳糖通过α-1，4-糖苷键连接葡萄糖而形成的二糖，工业上主要由牛乳清中提取得到。乳糖在制药领域应用广泛，主要用作药物制剂的填充剂、稀释剂和矫味剂，广泛应用于片剂、胶囊剂、颗粒剂和冻干制剂等。相比于淀粉、糊精等其他填充剂，乳糖具有吸湿性低、可压性好、且稳定性和流动性良好等优点。 《中国药典》2015版四部中辅料乳糖项下有关物质采用氨基色谱柱分离，示差检测器进行检测，但氨基柱柱效下降较快、分离度差，且示差检测器具有不能使用梯度洗脱导致分离度差、灵敏度低等缺点。本实验采用高效阴离子交换色谱柱进行分离，脉冲安培检测器进行检测，杂质分离度好，检测灵敏度高。 仪器 离子色谱仪 ( Thermo Scientific'MICS-5000+ 高压离子色谱)，配置： 一梯度泵 一柱温控制箱 一高压六通进样阀 一安培检测器 AS-AP自动进样器 (Thermo ScientificM) Chromeleon Chromatography Data System 7.2 耗材 Thermo ScientificM Target2M Nylon Syring Filters (0.45um， 30mm， P/N F2500-1) 一次性使用无菌注射器，5mL(上海双鸽实业有限公司) 试剂和标准品 去离子水，18.2MQ-cm (Thermo Scientific GenPure ProUV-TOC， P/N 50131948) 醋酸钠(Thermofisher Scientific， P/N 059326) 氢氧化钠溶液(50%(w/w)水溶液， Alfa Aesar) 半乳糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 蔗糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 果糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 取半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖各约100 mg，精密称定，分别置100mL量瓶中，加去离子水适量，振摇使溶解，用去离子水稀释定容至刻度，摇匀，分别精密吸取半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖溶液各1ml， 置100 ml量瓶中，加去离子水稀释定容至刻度，摇匀，即得混合标准贮备溶液。 标准系列溶液 精密吸取混合标准贮备溶液 10ml， 置100 ml量瓶中，加去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得浓度为1mg/L 混合标准中间溶液。分别精密吸取标准中间溶液(1mg/L)1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、20.0mL置6个100 mL的量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20 mg/L 混合标准系列溶液。 样品前处理 样品：取本本约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。 加标样品：取本品约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入混合标准贮备溶液10ml， 加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。 实验条件 分析柱： Thermofisher Scientific CarboPac PA1(250×4mm)(P/N 039658) 保护柱： Thermofisher Scientific CarboPac PA1 Guard(50×4mm) (P/N039657) 淋洗液： NaOH梯度淋洗，梯度洗脱程序见表1 表1.梯度洗脱程序 时间(min) NaOH 浓度(mmol/L) 0 16 22 16 22.1 100 37 100 37.1 16 60 16 流速：1.0 mL/min 进样体积：25pL 检测方式：脉冲安培检测，Au电极(P/N 061875)， Ag/AgCI 参比电极(P/N 061879)，标准糖四电位检测器温度：30℃ 运行时间：60 min 结果与讨论 色谱条件的优化与样品浓度的选择 当样品浓度较高时，乳糖主成分峰较大且在半乳糖和葡萄糖保留时间附近有台阶影响杂质的定量；同时当柱温较高时，乳糖中转化的乳果糖色谱峰较宽，影响其他糖类物质的分离。通过降低样品浓度和降低柱温，调整淋洗液浓度，可以减小乳糖和乳果糖对半乳糖和葡萄糖杂质峰分离的影响，最终选择浓度为 16 mmol/L NaOH为淋洗液，柱温为15℃，样品浓度为 100 mg/L的分析条件，此条件下可以实现四种杂质和主成分的相互完全分离。在上述条件下，标准品的色谱图如图1所示。 图1.标准溶液色谱图(0.1mg/L) 方法的重现性、线性范围和检出限 将0.1 mg/L的标准溶液连续进样5针，四种组分峰面积的 RSD 均小于2.0%，表明精密度良好。将上述标准系列溶液分别进样分析后，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标建立标准曲线，其线性范围、回归方程、相关系数和检出限均见表2。 表2.标准曲线的线性方程、线性范围和检出限 分析物 标准拟合方程 线性范围 相关系数 检出限 (pg/L) (r) (pg/L) 半乳糖 y=6.6967x-0.0071 0.01-0.2 0.9999 0.001 葡萄糖 y=6.3681x-0.0062 0.01-0.2 0.9999 0.001 蔗糖 y=4.2943x-0.0107 0.01-0.2 0.9997 0.002 果糖 v=4.3403x-0.0166 0.01-0.2 0.9997 0.003 实际样品分析及加标回收试验 取乳糖样品，按加标样品前处理方法处理和上述色谱条件进样分析，其测定结果见表3，实际样品色谱图见图2，加标样品色谱图见图3。回收率结果见表4. 表3.实际样品测定结果 样品名称 半乳糖 葡萄糖 蔗糖 果糖 1 0.04 0.02 ND ND 2 0.03 ND ND ND 3 0.01 ND ND ND 4 ND ND ND ND 表4.加标回收结果 样品名称 样品含有 测得浓度 加入浓度 回收率 平均回收 量/pg /mg/L /mg/L /% 率/% 半乳糖 / 0.1006 0.1 100.6 / 0.0998 0.1 99.8 100.2 葡萄糖 / 0.0997 0.1 99.7 / 0.1001 0.1 100.1 99.9 蔗糖 / 0.1001 0.1 100.1 / 0.1007 0.1 100.7 100.4 / 0.0992 0.1 99.2 果糖 / 0.1006 0.1 100.6 99.9 图3.加标样品分析色谱图 结论 离子色谱脉冲安培法检测辅料乳糖中半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖杂质，方法灵敏度高，准确度好，可用于控制辅料乳糖中这些杂质糖的含量。 图2.实际样品分析色谱图 Orbitrap组学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 全国服务热线：8008105118 thermoscientific 4006505118(支持手机用户) A Thermo Fisher Scientific Brand