致病微生物中不定靶代谢组学分析检测方案(气质联用仪)

thermoscientific 实验条件 应用 GC Orbitrap 质谱仪进行致病微生物不定靶代谢组学研究 作者：Cristian Cojocariul， Stefan Weidt， Jeni Haggarty?，Paul Silcock 和 Karl Burgess''Thermo Fisher Scientific， Runcorn， UK； GlasgowPolyomics， University of Glasgow， Glasgow， UK 关键词：代谢组学，Q Exactive GC，病原细菌，生物膜， Staphylococcus aureus， Candida albicans 简介 全世界人民都饱受病原细菌造成的感染困扰。虽然已有相当数量的疫苗和抗生素被用于病原微生物的防治，这些药物的有效性却日趋令人担心。病原细菌既可以以同种个体聚集的形式形成单一菌种的生物膜，也可以多个菌种混合聚集形成多菌种生物膜。其中 Candida albicans (白色念珠菌)就是一种造成生物膜形成的重要真菌，同时它也是血液感染的第四大元凶，并且致死率最高。 此外，研究发现 C. albicans 生物膜还能与原原细菌 Staphylococcus aureus (金黄色葡萄球菌)共同形成生物膜。C. albicans 与 S. aureus 的共同作用在老鼠?和人体内都呈现出一种协同效果，造成致病性和死亡率上升。然而，在代谢水平上，我们还对造成这种协同效应的元凶几乎一无所知。 在本研究中，我们以 C. albicans 和 S. aureus 的相互作用为研究对象，利用气相色谱(GC)与高分辨质谱仪(HRMS )联用的方法进行了不定靶代谢组学分析。为检测及鉴定出有统计意义的、有助于理解这两种病原菌的相互作用的小分子代谢物，我们对 C. albicans 和 S. aureus分别进行了独立纯培养和混合共培养，并对这两种病原菌菌体本身以及培养基均进行了研究。 为厘清 C. albicans 和 S. aureus 之间的生化相互作用并鉴定出在这协同关系中起到关键作用的小分子代谢物，我们使用了一台 Thermo Scientific M Q ExactiveM GCOrbitrapM 进谱仪进行本研究。该高质量分辨率台式GC-MS 分析平台性能优越，能够以稳定的 sub-ppm 质量准确度确保全扫分析的灵敏度和选择性，对保证化合物鉴定和确证结果的可靠性至关重要。此外， Q Exactive GC系统的大动态范围和快扫速支持同时检测高浓度和低浓度的代谢物，使得谱峰解析和化合物定量分析结果更为可靠。更重要的是，实验数据可以在现有的商用谱图库(例如NIST 或 Wiley) 或定制的高分辨代谢物谱库中进行检索，以进行推断代谢物的鉴定。 样品前处理 所有实验都使用 Candida albicans 实验菌株 SC5314( ATCC MYA-2876 ) 和 Staphylococcus aureus Newman菌株(NCTC 8178/ATCC) 进行。分析样品包括分别独立纯培养和混合共培养的 Candida albicans 和 Staphylococcusaureus 菌体，以及新鲜培养基和已用于菌株培养的培养基。此外，取少量每个生物样品进行混合，制成混合样品以作质控样品(QC)，用于在样品前处理、数据采集和数据处理步骤中评估同批次制备样品间的差异。此外还利用代谢物纯品标样，包括糖、磷酸糖苷、磷酸戊糖通路中间体，和氨基酸等，来对应用 NIST 谱库鉴定出的代谢物进行了确证。关于进行生物膜培养的具体条件以及菌体内、菌体外代谢物的提取操作等具体细节请参见参考文献。。4 样品衍生 所有培养基和菌体样品都进行了化学衍生处理(甲氧基化衍生，和硅烷化衍生)，以提高样品中化合物组分的挥发性，便于进行气相色谱分离。取30 uL 培养基或菌体样品，汤加1cg-葡萄糖(2nmol)， D27-十四烷酸 ( Myristic Acid，2 nmol) 和鲨肌醇(Scyllo-Inositol，1y1 nmol)作为内标以对进样量进行监测和校正。 为确证化合物鉴定结果，对包含糖类、磷酸糖苷、磷酸戊糖通路中间体，和氨基酸等化合物标准品的标样混合物进行与实验样品相同的衍生处理。样品和标品经干燥后，加入50 pL 20 mg/mL (w/v) 盐酸甲基羟胺(methoxyamineHCI)的吡啶溶液，在60℃孵浴120 min。在甲氧基化衍生处理之后，加入50 uLMSTFA+1%TMCS(N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷)，并在80℃再孵浴 120 min， 完成硅烷化衍生。将样品冷却到室温，并在进行 GC-MS分析前向每个样品内添加1uL保留指数指示烷烃混合物。对于不定靶代谢组学来说，保留时间的预测尤为重要，因为该参数能够提高在谱库中进行搜索和化合物鉴定时结果的可靠度。 GC-MS分析 为降低分析误差对结果的统计影响，对衍生后的样品按跨批次的随机顺序进行分析。进样使用 Thermo ScientificTriPlusMRSHM机械臂，而 GC 分离使用 Thermo ScientificMTRACE M 1310气相色谱仪和一根 Thermo ScientificMTraceGOLDTM TG-5Sil MS 30 m 长×0.25 mm 内径x 0.25 pm 涂层厚度的气相色谱柱进行(表1)。Q ExactiveGC 质谱仪在 El源的全扫描模式下运行，并使用内部锁定质量对其进行校正(表2)。 表1.GC 和进样器条件 TRACE 1310 GC 参数 进样体积(uL) 1 衬管 单细径(P/N 453A1345) 进样口温度(℃) 250 进样模块和模式 SSL， 分流1：100 载气，(mL/min) He，1.0 柱温箱程序 温度1(℃) 70 驻留时间(min) 4 温度2(℃) 320 升温速率(℃/min) 20 驻留时间( min) 8 表2.质谱仪条件。 Q Exactive GC 质谱仪参数 传输线温度(℃) 250 离子化模式 EI 离子源温度(℃) 230 电子能量(eV) 70 采集模式 全扫描 质量范围(Da) 50-650 质量分辨率(FWHM at m/z 200) 60，000 锁定质量(m/z) 207.03235 数据处理 对采集到的数据按照不定靶代谢物检测和鉴定流程进行分析。该流程使用 Thermo ScientificM Compound Discoverer软件对多个样品中代谢物的相对丰度进行比较。该方法无需事先进行化合物鉴定，而是依靠后续差异统计分析(例如PCA 和火山图)进行。通过统计分析鉴定出的代谢物会经 Thermo Scientific M TraceFinderM软件进一步分析、评估，实现半定量分析(计算改变倍数)和代谢物推断。谱峰解析(解卷积)由 TraceFinder 自动进行，谱峰注释 借助 NIST 2014 质谱图数据库实现，分析所有搜索指数 阈值>700的峰。化合物鉴定主要基于一个总的可靠度评分进行。该评分综综反映了 NIST 谱图匹配结果以及根据NIST Thermo Scientific 鉴定出的分子离子的元素组成能够合理解释的碎片离子谱图的百分比。 结果与讨论 本研究的数据处理工作流程使用 Compound Discoverer 软件和 TraceFinder 软件。Compound Discoverer 支持分组 比较分析和利用参数提取重要代谢物，参数包括 QC样品中的峰面积可重现性百分数%CV、计算得到的概率值( p<0.05)、样品组间浓度改变倍数，等等(图1)。TraceFinder 主要利用谱库检索和精确质量信息实现化合物解析和推断。 图1.不定靶代谢组学数据处理工作流程。Compound Discoverer 软件基于主成份分析结果来找出样品间的差异，或利用火山图进行分组比较。CompoundDiscoverer 软件中的数据可以导出(以*.csv 或 *.xls格式)，以供进一步的统计分析。化合物鉴定使用 TraceFinder 或通过与化合物纯品进样分析得到的保留时间和质谱图进行比对得到 在进行任何统计检测之前，四前样品组在 RT = 9.04 min处洗脱的色谱峰的强度差异已是一目了然(图2)。 为了能自动提取具有生物学意义的信息，我们用CompoundDiscoverer 对样品进行了比较分析，并通过 PCA 分析测定了组间差异。 Compound Discoverer 支持自动、易设置的色谱图对齐功能，谱峰检测、数据归一化，以及可靠的统计分析。经此分析，我们在所有47个样品中检测到了大量色谱峰(~17，000)。 在PCA分析中，培养基样品和菌体样品之间呈现明显的样品分组(图3)。有趣的是，培养基样品之间也有差异，用于 C. albicans 和 S. aureus 共培养的培养基自成一簇。这可能是由于这两种微生物对培养基中的化合物摄取速率不同，和/或是由于代谢物排泄的速度不同导致。此外，QC样品聚合的非常紧密，说明分析的重现性很高(<20%RSD)。 图2.仅培养基的 TIC 色谱图(EI，全 扫描数据)(a)， C. albicans 培养基(b)， S.aureus (c) 和 C. albicans和S. aureus(d)共培养菌液的培养基。RT=9.04 min 处标示出的谱峰后经鉴定发现是甘氨酸，该化合物在 S. aureus 培养基几乎被耗尽 图3.主成份分析(PCA)结果中可见培养基样品和菌体样品的清晰差异。仅培养基(Mo)， S. aureus 培养基(SAM)，calbicans 培养基(CAM)，和共培养菌液的培养基(SCM)各成一簇。S.aureus 菌体(SAC)， C. albicans 菌体(CAC)和共培养生物膜(SCC)样品中提取的胞内代谢物同样形成了各自的聚类簇 PCA分析之后，利用 TraceFinder 对数据进行了进一步分析，推定化合物的鉴定通过检索 NIST 和内部开发的高分辨代谢组学谱图库进行。首先基于谱库匹配得分(SI>700)和高分辨筛选得分(HRF)计算一个总分(计算方法参见文献)，44然后根据总分进行化合物鉴定。图4为在 TraceFinder 解析浏览器中审阅肌醇的(myo-inositol)鉴定结果，可见在培养基样品中的平均总得分>98。 除了推定化合物的鉴定， TraceFinder 软件还支持对每个在样品组间出现显著丰度差异(p<0.05)的代谢物进行轻松的数据可视化处理。在培养基样品组和菌体样品组之间出现显著丰度变化的生物标记物示例参见图5。 97.7 70.07772 9288 97.954 217.107483 42450152 4-dimethyl-，trans- 97.984 9898.2898.3 111.116875 294328 98 71.085541a98.28 217.10748398.3 111.116852 68015100114694 图4.在 TraceFinder 软件谱峰解析浏览器中展示肌醇鉴定结果(a)，作为鉴定依据的总(平均)得分(b)，以及参与鉴定的、保留时间对齐的培养基样品明细sT(c)。NIST 谱图匹配结果(d)，经解析谱图(e)以及测得离子和相应质量误差的列表(f)也显示在图中，质量误差根据理论化学元素组成计算 图5. TraceFinder 软件浏览器中样品间保留时间对齐处理后的谱峰视图(a)，谱峰鉴定依据是NIST 检索结果和HRF评平(b)，样品间的谱峰重叠(c)以及对选定化合物(此处为4-羟基丁酸)在培养基样品间的峰高变化趋势分析。对照组样品是仅培养基，C.albicans (CAM)， S. aureus (SAM)和用于C. albicans 和 S. aureus (SCM)共培养的培养基 尽管总分机制已经使得化合物鉴定的结果可信度很高了，我们还是通过比对推定代谢物与相应标准品(糖类，磷酸糖苷，磷酸戊糖和氨基酸混合标样)经过同样的衍生处理并用同一个 GC-MS 方法分析所得的保留时间和质谱图来进一步提高了结果的可信度。 图6给出了利用标品进行化合物鉴定的一个实例。如图所示，鲨肌醇(scyllo-lnositol) 的 6TMS衍生物浓度在 S. aureus 菌体提取物中显著升高。我们遵循此工作流程，鉴定了所有在样品组间呈现显著的浓度倍数差异( fold changes) 且 p-值<0.05的代谢物的。 对菌体提取物的分析结果显示， S. aureus 和 C. albicans各自的纯培养菌液和混合培养菌液之间都呈现出较大差异并在结果中出现分离。 磷酸糖苷在菌体样品中也相当常见。所有用过的培养基都有一个共同特征，即氨基酸和糖类的大量消耗，这与富营养培养基中菌体的迅速生长不无关系。 有趣的是，较之单菌种培养基，共培养的培养基中的景天庚酮糖-7-磷酸( sedoheptulose-7-phosphate)水平显著升高，该化合物很可能是由 C. albicans 分泌以控制S.aureus 生长的。4 图 6. S. aureus 菌体提取液中利用糖类化合物标准品进行鲨肌醇 6TMS 衍生物的确证。确衣依据包括谱库(NIST搜索指数)、保留时间、谱图可信度和测得碎片离子的 sub ppm 质量准确度 结论 ·这些实验的结果显示，绝大部分 Candida albicans 和Staphylococcus aureus 之间互相作用都是跟糖类合成和以糖类作为主要碳源的代谢相关的，尤其是景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose-7-phosphate) 代谢。 ·Compound Discoverer 和 TraceFinder 自动化数据处理使得检测及鉴定发生具有统计显著性的改变的代谢物变得流畅、简单。 。更为重要的是，本文描述的代谢组学工作流程能够促进及时且可靠的数据采集、数据处理和结果阐释。 ·这些实验取得的结果证明 Q Exactive GC 系统是一个有力的分析工具，可以用于研究复杂的细菌相互作用中的代谢变化，有助于提供前所未知的、关于分子水平上病原菌之间的相互作用的信息。 ·总而言之， Q Exactive GC 质谱仪是一种独特的分析工具，仅需简单设置即可通过全扫高分辨实验检测大量小分子代谢物。 1. Crump， J. A.， and P. J. Collignon. 2000. Intravascularcatheterassociated infections. European Journal ofClinical Microbiology & Infectious Diseases. 19：1-8. 2. Carlson， E. C. 1988. Synergism of Candida albicans anddelta toxin producing Staphylococcus aureus on mousemortality and morbidity： protection by indomethacin.Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie undHygiene： 1. Abt. Originale C： Allgemeine， angewandteund okologische Mikrobiologie. A 269：377-386. 3. 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