肝素钠中亚硝酸根检测方案(离子色谱仪)

9001wo’Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific Key words： lon chromatography； conductivity； lonPac AS19； dalteparin；nitrite 引言 低分子肝素(low-molecular-weight heparin， LMWH)是近年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，其抗血栓作用优于肝形，而抗凝血作用低于肝素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等优点，目前已广泛应用于临床。根据LMWH的来源、生产工艺、末端结构的不同，LMWH分为许多不同的种类，如达肝素钠、依诺肝素、纳肝素钙、帕肝素钠、汀肝素钠等。达肝素钠 ( Dalteparin Sodium) 是低分子肝素的一种，由亚硝酸降解肝素得到，重均分子量5600-6400，峰位分子量6000，硫酸化程度为2.0-2.5/双糖单位"。 达肝素钠的生产过程中使用了亚硝酸，而亚硝酸根是一种毒性物质，在人体特定的环境条件下，可以合成一种很强的化学致癌物——N-亚硝基化合物，能够诱发几乎所有内脏器官的肿瘤。因此，检测达肝素钠中残留的亚硝酸根含量，对保证患者用药安全具有重要意义。目前欧洲药典使用离子色谱-安培检测法测定达肝素钠中亚硝酸根含量②，国内低分子肝素标准中使用化学方法对亚硝酸根进行限度检查，无含量测定。欧洲药典的方法未对样品进行前处理，达肝素钠保留在色谱柱上，缩短柱寿命，且重现性较差。本文建立了离子色谱法分离、电导检测器检测达肝素钠中的亚硝酸根含量的方法，灵敏度高，线性、回收率、重现性好，可以延长色谱柱寿命。 仪器： ICS3000系统(EG淋洗液发生装置)； 分析柱： lonPac AS19， 250×4mm； 保护柱： lonPac AG19， 50×4mm； 柱温：30℃； 淋洗液：氢氧化钾(KOH) 梯度淋洗；5-40mmol/LKOH， 0-35min；40-5mmol/L， 35-35.1min； 流速：1.00mL/min； 定量环：100pL 抑制器： AMMS4mm， 再生液为25mmol·L硫酸 检测方式：抑制型电导 样品前处理 精密称取达肝素钠0.4g，加水溶解并稀释至10mL。精密量取1mL至离心管中，加无水乙醇9mL，摇匀，10000rmin离心20min。取上清液，过0.22um滤膜，续滤液进样。 结果和讨论 样品前处理条件的选择 由于达肝素钠是多羟基的多糖类物质，碱性条件下离子化，在离子交换柱上有很强的保留，即使使用强的洗脱溶液如1mol·L"氯化钠也很难将其洗脱。达肝素钠侵占色谱柱中的位点，可造成色谱柱容量下降，离子保留时间缩短。去除待测液中的达肝素钠后进样，可解决这一问题。 去除达肝素钠的方法主要有乙醇沉淀、阳离子表面活性剂沉淀、超滤、透析等。阳离子表面活性剂的引入，会降低色谱柱的柱效；超滤膜可能含有亚硝酸根残留，影响测定结果；透析需要的时间较长。与以上三种方法相比，醇沉操作简单、快捷，重现性好，且不易引入杂质，因此本方法选用醇沉法对样品进行前处理。 色谱柱的选择 样品溶液含有的阴离子，除达肝素钠正常含有的硫酸根、残留的亚硝酸根外，还含有氯离子、磷酸根离子及其他未知阴离子。分别使用lonPac AS11-HC， lonPacAS15， lonPac AS19， lonPac AS23等色谱柱进行分离。在氯离子和亚硝酸根之间出现未知色谱峰，保留时间与亚硝酸根接近。降低淋洗液浓度，可增加未知峰与亚硝酸根的分离度，但同时也造成分析时间延长。比较以上不同色谱柱的测定结果，在保证未知峰与亚硝酸根分离度的前提下， lonPac AS19色谱柱的分析时间最短，亚硝酸根出峰时间可控制在10min以内。 lonPac AS19色谱柱良好的分离效果与其高容量有关。 图1.样品分离图谱 使用电导检测器时，淋洗液有很高的检测信号。抑制器可降低淋洗液的背景电导，增加被测离子的电导值，改善信噪比。常用的抑制模式有化学抑制、电抑制等。测定阴离子时，化学抑制使用酸作为再生液；电抑制使用外接水或电导池后流出的废液作为再生液。本方法的待测溶液中含有高浓度的乙醇，在电抑制模式下，乙醇有响应且会干扰亚硝酸根的测定，而化学抑制模式下乙醇无响应值。因此，本法采用25mmol·L硫酸作为再生液，选用膜抑制器化学抑制。 重现性、线性和灵敏度 取样品溶液分别进样6次，保留时间RSD为0.1%， 峰面积RSD为0.5%. 线性范围取25~1000pg·L硝酸酸根标准溶液进样，以峰面积A对浓度C进行回归计算，回归方程为：A=0.000787C+0.001007， r=0.9997 取20ug·L'的亚硝酸根标准溶液进样，测定其峰高微0.060uS， 按照3倍信噪比计算其检测限为1pg·L1，按照10倍信噪比计算其定量限为3.3pugL'。 实际样品分析及加标回收 精密称取样品适量，精密量取标准溶液适量加入，分别制成加标浓度为25，50，100， 200pg·L'的溶液，回收率分别为98.5%~107.9%(n=3)，见表1。 表1.回收率试验测定结果 Tab 1 Results of recovery test 样品溶液含量 加标量 检出量 回收率 Amount in sample E Spiked Found Recovery/% solution/pg·L /pg·L -1 /pg·L 25 187.4±2.8 107.9 160.4 50 210.8±2.8 100.8 100 259.0±3.0 98.5 200 361.6±4.4 100.6 thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd i ts s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548 综上所述，本文建立的亚硝酸根的测定方法，不仅操作简单，灵敏度高，更具有重现性高，更好的保护色谱柱等优点。本方法不仅可用于低分子肝素的质量控制，其前处理方法和检测方法也适用于其他多糖类药物中的阴离子测定。 ( 参考文献 ) ( [1] LI Jing (李京)， FAN Hui-hong (范慧红)， XU Kang-sen ( 徐康森). St u dy on th e cu r rent status andthe quality standard of low-molecular-weight heparin(低分子肝素药用现状及质量标准概 况). Chin J Biochem Pharm (中国生化药物杂 志)，2004，25(1)：53 ) ( [2]EP7.0(欧洲药典第7版) [S] ) ( [3] Drug Specifications Promulgated by State Food and Drug Administration ， P R China (国家食品药品监督管理局标准). WS1-(X-149)-2005Z )