霉酚酸酯中霉酚酸酯降解产物检测方案(液相色谱仪)

引言 强制降解实验能揭示各种环境因素对原料药和制剂的影响。它能提供药品安全信息、确定推荐储存条件、保质期和分析方法的特异性。而降解产物的信息能帮助改进化合物或配方的发展。霉酚酸酯(MMF)的商标名称为骁悉(CellCept)，是一种免疫抑制剂和霉酚酸(MPA)的前体药物。MMF 广泛的应用在治疗器官移植排异反应和自体免疫疾病的移植药物中，为本研究选择的模型化合物。 本文采用高分辨台式质谱仪 Q Exactive Focus 开发了一种快速可靠的分析霉酚酸酯降解产物的完整工作流程，采用 HRAM全扫描和数据依赖 MS/MS 在高分辨率和极性切换模式下实现降解产物的快速鉴定。HRAM MS 和 MS/MS 谱图以及正/负离子模式切换，能可靠完成降解产物的定性和结构鉴定。 实验方法 液相色谱方法 UHPLC： Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC 色谱柱： Thermo Dionex Acclaim 2.1×150 柱， 2.2 um 柱温：35℃，流速：0.5mL/min，进样体积：1pL 流动相：A-0.1%甲酸水溶液 B-含0.1%甲酸的乙腈 梯度洗脱： 0-0.5 min 保持20%B， 然后在 15 min内线性增加到40%B 质谱仪： Thermo Scientific Q Exactive Focus 台式高分辨质谱仪 HESI-II离子源：EESI正/负离子切换 全扫描采集： m/z 120-1000 amu， 分辨率为70，000(FWHM@m/z 200) MS/MS采集：17，500分辨率下数据依赖采集， HCD 归一化碰撞能：35%，25%阶梯变化 ·霉酚酸酯储备液，浓度为2.5 mg/mL的乙腈溶液，称取25mg标准品配制在10 mL 乙腈中。 ·盐酸(0.01N，pH2)， 乙酸铵(5mM，pH6)，氢氧化钠(0.01N， pH8)和过氧化氢(3%， pH8.2)。购买的30%过氧化氢用水稀释10倍后用于酸、碱和氧化研究。用氢氧化铵或乙酸调节强制降解溶液 pH值。 ·用如上 pH 2、pH6、pH8的溶液和过氧化氢(3%， pH8.2)将浓度为2.5 mg/mL 的霉酚酸酯储备液稀释10倍配制浓度为 0.25 mg/mL 的强制降解溶液。强制降解溶液放置于60℃烘箱中。在放置的第1、20、48和72小时分别取样，直接进样到 LC/MS 中进行分析。 实验与讨论 1.UHPLC-高分辨率 MS 快速测定降解产物 采用UHPLC-高分率率MS快速分析降解产物。高质量的HRMS 全扫描图谱为测定降解产物的元素组成提供了重要信息，并从随后的数据依赖 MS/MS 获得分子离子的裂解信息。 图1.MMF 在 pH 2.0和60℃条件下反应1、20、48和72小时的总离子流色谱图 图 2. MMF 在 pH 2.0、3.5、6.0和8.2条件下，在3%过氧化氢中反应一小时的总离子流色 Time(min) 图3. MMF 在 pH 8.2和60℃条件下反应1、20、48和72小时的色谱图 2.高分辨率 MS/MS 鉴定降解产物的结构 具备阶梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解离功能产生了信息量丰富的碎片，能更轻松地完成降解产物的结构鉴定。 图4.降解产物 D11的全扫描和数据依赖 MS/MS 图谱 3.极性切换功能全面鉴定降解产物 快速正/负离子切换实验采用在正离子模式下完成一次全扫描，然后进行数据依赖 MS2HCD 裂解。随后转换到负离子模式下进行全扫描和数据依赖 MS2HCD 裂解。自动极性切换提供了 不同但是互为补充的降解产物的裂解信息。这些独特极性的碎片能帮助确认结构鉴定结果(图5)。 图5.降解产物 D3的HRAM全扫描和 MS/MS 图谱 图6. UHPLC-HRAM 鉴定出的降解产物的可能结构 结论 本文研究了霉酚酸酯 API在 pH2.0、3.5、6.0和8.2条件下的热和过氧化氢降解。采用台式高分辨率质谱仪Q ExactiveFocus 与 UHPLC 系统联用快速准确地分析了降解产物。高分辨率准确质量数测定(HRAM)的全扫描图谱可获得降解产物元素组成的关键信息，实现了快速的鉴定。信息量丰富的高能量碰撞解离(HCD) MS/MS图谱有利于准确鉴定降解产物。全扫描和 MS/MS模式下的正/负离子切换模式能全面鉴定降解产物。数据分析软件 Mass Frontier 极大的提高了降解产物结构解析的速度和可靠性。QExactive Focus 台式 OrbitrapMS 具有强大的功能，能快速高效地完成降解产物分析，从而显著提高了药物研发过程中降解产物的鉴定通量。 SCIENTIFIC Thermo Fisher赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线： 支持手机用户)SCIENTIFIC客服邮箱： sales.china@thermofisher.com