细胞中G蛋白磷酸化检测方案(生理/药理/神经仪器)

介绍 本研究展示了如何在 SpectraMax@i3多功能酶标仪中应用CatchPoint@ cAMP荧光试剂盒监测腺苷酸环化酶激活剂forskolin对HEK293细胞的影响(如图1)。 G蛋白偶联受体(GPCRs)是重要的跨膜蛋白，能将胞外信号传导入胞内，引起信号逐级放大的级联反应，导致胞内某些蛋白活性或表达的改变[1]。3'，5'-单磷酸化环腺苷(cAMP)作为第二信使参与GPCR活化后的下游反应。当胞外配体作用于GPCR时， GPCR构象发生改变，激活胞内连接的G蛋白。接下来的信号传导路径与被激活的G蛋白类型有关。其中当Gs蛋白被激活时，会导致腺苷酸环化酶活化引起的胞内cAMP浓度上调，进一步激活蛋白激酶A，最终促进一些目标蛋白的磷酸化，这些目标蛋白可能参与了例如多巴胺神经信号传导、葡萄糖再生反应、血管扩张、细胞有丝分裂、卵子成熟等重要生理生化过程[2-6]。 CatchPoint cAMP荧光检测试剂盒采用免疫竞争原理测得cAMP浓度(如图2)，仅需一步洗脱，且反应底物加入后短可放置10分钟，长可延至24小时后再检测，信号稳定灵敏。 材料 ·CatchPoint cAMP荧光则测试剂盒(Molecular Devices ， 货号R8088) ( ·HEK293丝胞 (ATCC编号CRL-1573) ) ·KRGB缓冲液 (Sigma， 货号K4002) ·碳酸氢钠(Sigma， 货号S5761) ·PBS缓冲液 (Life Technologies，货号10010) ·磷酸二酯酶抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，IBMX (Sigma，货号17018) ·30%过氧化氢溶液 ·MEM培养基 (Corning， 货号10-010) ·胎牛血清 (Gemini Bio-Products，货号100-106) ·青霉素 (Life Technologies，货号15070-063) ·Forskolin (Sigma， 货号F6886) ·多聚-D-赖氨酸包被96孔板 (Corning，货号354413) ·SpectraMax@i3多功能酶标仪 · SpectraMax@ MiniMaxTM 300细胞成像系统 优势 通过检测cAMP浓度准确衡量GPCR活性 ，只需一步洗脱 信号稳定(10分钟-24小时) ·Z因子为0.91 ·MultiWash+TM 洗板机 方法HEK293细胞培养于全生长培养基(MEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素)中，铺满T75培养瓶瓶底80-90%。0.05%胰酶消化后收集细胞，按照25000个/孔的密度接种到96孔板中(多聚-D-赖氨酸包被，黑壁底透)，接种密度可在25000-100000个/孔范围，37°C、5%CO2环境下细胞贴壁培养至少18h。 荧光检测前，先用SpectraMax@MiniMaxTM300细胞成像系统透射光通道观察细胞，以掌握其生长饱和情况，并应用Stain-FreeTM无标记细胞计去法准确测量细胞数目或覆盖面积百分比(即饱和度)，以达到质量控制的目的(如图3)。细胞饱和度高且孔间差异小的行被挑选进行CatchPoint检测。室温下先用0.75mM IBMX预乍用细胞10分钟，然后37°C下用系列浓度梯度的forskolin(起始孔浓度1000nM， 其他孔按1：3依次稀释)处理细胞15分钟。药物处理后按照CatchPoint检测试剂盒说明书裂解各孔细胞。 接下来按照产品说明书进行操作检测。cAMP标准样品检测得到一条标准曲线，以确认试剂盒功能是否正常，并可通过该拟合方程式计算出细胞样品中cAMP浓度。过程中洗脱步骤使用MultiWash+洗板机。红色底物StopLight加入样品30分钟后用SpectraMax@i3多功能酶标仪读数。SoftMax@Pro软件执行所有数据采集、分析和曲线拟合功能，另外还在模板库中提供了专门的CatchPoint cAMP检测试剂盒预设模板。 结果 在药物刺激前需掌握细胞饱和度情况，该实验中采用了Minimax成像系统以及StainFree无标记技术检测各孔中细胞覆盖面积百分比(如图3)。根据检测结果，A行和C行因为不同孔间均一的细胞生长饱和度被选作待测样品行。各处理孔提取出细胞裂解后的样品进行检测。 图2： CatchPoint cAMP检测原理细胞中含有的未标记cAMP与试剂盒中提供的HRP标记cAMP竞争结合上孔板包被的cAMP抗体。通过检测HRP活性降低可反映细胞内cAMP含量增多。 Rows of 96-well microplates 图3：利用MiniMax细胞成像系统和无标记技术检测HEK293细胞饱和度 A行和C行具有相似的细胞饱和度百分比以及最小的孔间差异，因此被选中进行检测 图4：cAMP标准曲线 EC50为3.3nM， 该值与已发表数据一致，样品检测2个复孔 图5：HEK293细胞样品检测结果得到一条forskolin浓度响应曲线，从起始浓度1000nM开始按1/3稀释的浓度梯度，每种处理样品检测2个复孔， EC50 为2.3nM 图4和5分别显示了cAMP标准曲线和细胞样品药物浓度响应曲线，两条曲线均用4参数拟合。标准曲线得到EC50=3.3nM，该值与已发表数据据致[7]，其中Z因子为0.91。Forskolin浓度响应曲线测得EC50=2.3nM， 该值符合根据HEK293细胞贴壁情况推导的结论。 订购信息 试剂名称 描述(反应次数) 货号 CatchPoint cAMP 96-well Explorer Kit 192次 R8088 CatchPoint cAMP 96-well Bulk Kit 960次 R8089 CatchPoint cAMP 384-well Explorer Kit 768次 R8044 CatchPoint cAMP 384-well Bulk Kit 7680次 R8053 结论 CatchPoint@cAMP荧光检测试剂盒能通过测量cAMP浓度准确衡量GPCR活性，检测信号极稳定(可维持10分钟-24小时)，优异的Z因子值，应用酶标仪荧光强度功能进行CatchPoint cAMP检测成为高通量药物筛选的可靠选择。 该实验所使用的Molecular Devices酶标仪： 带MiniMaxTM 300细胞成像系统的SpectraMax@i3多功能酶标仪 MultiWash+TM 洗板机 ( 参考文献 ) 1. Zaccolo， Manuela.“cAMP signal transduction in the heart： understanding spatial control forthe development of novel therapeutic strategies." British Journal of Pharmacology 158.1(2009)：50-60. 2. Hanoune， Jacques， and Nicole Defer.“Regulation and role of adenylyl cyclase isoforms."Annual Review of Pharmacology and Toxicology 41.1 (2001)：145-174. 3. Griendling， Kathy K.， et al. “Modulation of protein kinase activity and gene expression byreactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology."Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology 20.10 (2000)：2175-2183. 4. Kemp， BruceE.， et al. “Dealing with energy demand： the AMP-activated protein kinase."Trends in Biochemical Sciences 24.1 (1999)： 22-25. 5. Etgen， Anne M.， Michael A. Ansonoff， and Arnulfo Quesada.“Mechanisms of ovariansteroid regulation of norepinephrine receptor-mediated signal transduction in the hypothala-mus： implications for female reproductive physiology.”Hormones and Behavior 40.2(2001)：169-177. ( 6. Chini， Eduardo N . ， e t al. “ Adrenomedullin su p presses mitogenesis in rat mesangial cells viacAMP pathway." B iochemical and Biophysical Research Communications 215.3 (1995)： 868-873. ) ( 7 . Hesley， Jayne， Janet D aijo， and A nne T . Ferguson.“Stable， sensitive， fluorescence-basedmethod for detecting cAMP.” B ioTechniques 33.3 (2002)： 692-694. ) 扫一扫关注我们的官方微信 Molecular Devices 大中华区 Email： info.china@moldev.com www.MolecularDevices.com www.MolecularDevices.com.cn ( 上海 电话：8 6 -21-3372 1088 北京 电话：86-10-64108669 成都 电话：86-28-65588820 台北 电话：886-2-26567585 香港巷 电话：852-2248-6000 ) ( 传真：86-21-33721066传真：86-10-64108601 传真：8 6 -28-65588831 ) ( 地址： 上 海市徐汇区宜山路1388号民润大厦8楼2 0 1103 地址：北京市朝阳区广渠东路3号中水电国际大厦612&613室 100124 地址：成都市锦江区东御街18号百扬大厦2208室610016 ) 传真：886-2-28948267 地址：台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼 传真：852-30102828 地址：香港皇后大道东1号太古广场三座4楼406-9