牛奶中恩诺沙星，环丙沙星，喹诺酮类检测方案(试剂盒)

·36.2011，45(9)：36~39/何丹婷，等中国兽药杂志 ·37·2011，45(9)：36~39/何丹婷，等 中国兽药杂志 牛奶中恩诺沙星和环丙沙星检测试纸的研制及性能测定 何丹婷，李艳伟，师伟，赵宁，徐 飞 (北京市维德维康生物技术有限公司，北京100085) [收稿日期]2011-05-26 [文献标识码]A [文章编号]1002-1280(2011)09-0036-04 [中图分类号] S859.84 [摘 要] 应用胶体金免疫层析技术建立了恩诺沙星和环丙沙星快速检测试纸，并对试纸条的检测限、特异性和稳定性等参数进行了确定。结果表明，该试纸条对牛奶样本的检测限为 50 ug/L，能够特异性地检测恩诺沙星和环丙沙星，与液相色谱-串联质谱方法检测的阴性样本符合率为97.8%。该试纸条在2℃~8℃或室温可保存12个月，可应用于恩诺沙星在牛奶中的快速筛查现场检测。 [关键词] 恩诺沙星；胶体金免疫层析技术；快速检测试纸 Research and Trait Identification of Colloidal Gold Strip for RapidDetection of Enrofloxacin and Ciprofloxacin in Milk HE Dan-ting，LI Yan - wei，SHI Wei，ZHAO Ning，XU Fei( Beijing WDWK Biotechnologgyy Co. ，Ltd，Beijing 100085，China) Abstract： The rapid test strip for detection of enrofloxacin and ciprofloxacin was developed based on colloidal goldimmune chromatographic technology， and its technical parameters， such as sensitivity， specificity and stabilitywere tested respectively. The results showed that the LOD of the strip was 50 pg/L and was specific forenrofloxacin and ciprofloxacin detection. The coincidence rate of negative samples was 97.8% compared withLC-MS/MS. The rapid test strip can be stored at 2℃~8℃ or room temperature for at least 12 months and beapplied for rapid enrofloxacin screening in milk. Key words： enrofloxacin； gold immune chromatographic assay； rapid test strip 恩诺沙星(Enrofloxacin) 与环丙沙星是属于喹诺酮类化学合成的抑菌剂，广泛应用于畜禽和水产养殖中支原体和细菌性疾病预防与治疗，但长期使用会造成组织中药物残留而影响人类健康，因此对恩诺沙星和环丙沙星的检测分析具有良好的经济效益和重要的社会意义1-2。国内外已有微生物法、色谱法、电化学法和免疫分析法研究的报道。本文应用制备的恩诺沙星的单克隆抗体(mAb)和胶体金免疫层析技术( GICA) 研制出残留快速检测 胶体金试纸，以期为基层大规模的初筛提供快速、简便的检测方法。 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验仪器 Biodot 喷膜机，美国Biodot公司产品；恒温电磁搅拌器，国华电器；切条机，上海韩港电子科技；电热恒温培养箱，天津中环。 1.1.2 试剂和动物 氯金酸、柠檬酸三钠等化学试剂，北京化学试剂公司；恩诺沙星等各种交叉反 ( 基金项目：农业科技成果转化资金项目(2010GB2A000009) ) ( 作者简介：何丹婷(1984年-)，硕士，从事动物源性食品安全检测技术研究。E- mail： dantinghe@ sina. com ) ( 通讯作者：徐飞。 E -mail： aaaxufei@yahoo. com. cn ) 应药物为常规标准品，Dr. Ehrenstorfer Gmbh 公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)，Sigma公司；羊抗鼠IgG，为美国 Jackson ImmuneResearch公司产品；包被原由北京市维德维康生物技术有限公司制备。 Balb/c 小鼠和新西兰大白兔，国家兽药安全评价中心实验动物房提供；人工抗原 CIF -BSA(分子结合比为11：1)、分泌恩诺沙星特异性抗体细胞株(编号ENR5F1)、腹水抗体(间接 ELISA 效价1：2.56×10)、抗体亚型 IgG1，均为北京市维德维康生物技术有限公司制备保存。 1.2方法B-51 1.2.1 胶体金制备和质量鉴定 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，方法参见文献[6-9] 1.2.2 金标抗体的制备和纯化 0.1 mol/LK，CO， 调节胶体金溶液pH值至8.2，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入1mL 含0.35 mg 恩诺沙星抗体蛋白溶液。逐滴加入3 mL 5% BSA，持续搅拌10 min。 金标抗体溶液常温低速(1500 r/min) 离心 20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。红色上清溶液2℃~8℃，11 000 r/min 离心40 min。溶液分为三层，透明上清、管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1%BSA的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(PB)混悬至原量。平衡过夜，同上重复离心2次。最后用1%BSA 的0.01 mol/L PB( 含0.02%叠氮钠)将沉淀混悬为原体积的1/40，2℃~8℃保存。 1.2.3 胶体金免疫层析试纸的制备 用玻璃纤维XYZ3050 Biodot 三维喷点平台系统以8 pL/cm 将胶体金标记的恩诺沙星单克隆抗体点喷在玻璃纤维上，37℃烘干30 min；用 XYZ3050三维喷点平台系统以0.8 uL/cm 将抗原(0.5 mg/mL)点喷在硝酸纤维素膜上，即为检测线；在离检测线4mm 处喷上羊抗鼠 IgG (0.8 mg/mL)，即为质控线，37℃干燥2h。在塑料背板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，并在样品垫外面粘贴保护膜. 1.2.4 待检样品的处理与结果判定 取新鲜原奶样品600 pL，加入样品稀释液混匀后，80℃C水浴2min 后，用滴管取6~8滴滴于样品孔中，5 min 后判 定结果。若样品为阴性，加样后在T区出现一条紫红色条带；若样品为阳性，则T区不会出现紫红色条带。无论样品中有无恩诺沙星存在，C区都会出现一条紫红色条带。 1.2.5 胶体金免疫试纸检测限的测定 用阴性牛奶配制恩诺沙星和环丙沙星的标准溶液，终浓度分别为10、25、50、75、100 ug/L，按要求对样品处理后进行检测，每份样品重复5次，5 min 后目测判断结果。 1.2.6 胶体金免疫试纸特异性的测定 取恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氟甲喹、诺氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、四环素、链霉素、阿维菌素标准品，进行交叉反应率的测定，确定试纸条的特异性。 1.2.7 胶体金免疫试纸稳定性的测定 取三个不同批次的胶体金试纸，分别置于2℃~8℃和室温，于保存的第0、1、3、6、9、12个月取出，用阴性牛奶配制恩诺沙星的标准溶液3份，终浓度为25、50、75 ug/L，按要求对样品处理后进行检测，每份样品重复5次，5 min 后目测判断结果。 1.2.8 假阳性率的测定取经LC-MS/MS 确证的阴性牛奶50份，编号为1#~50#。按要求对样品处理后进行检测，每份样品重复5次，5 min 后目测判断结果。 1.2.9假阴性率的测定取经LC-MS/MS 确证的阴性牛奶120份，按农业部第235号公告规定的检测限浓度(100 pg/L) 添加恩诺沙星和环丙沙星各60份，按要求对样品处理处进行检测，5 min 后目测判断结果。 1.2.10 仪器比对 取50份空白牛奶样品，随机添加恩诺沙星标准品，制成50份盲样。分别采用胶体金免疫试纸和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)两种手段进行测定，依照下面公式计算阴性样本的符合率。仪器方法参照 GB/T 21312-2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》所述进行操作110。 阴性样本_试纸条阴性样本检出数-×100%。符合率-LC-MS/MS 阴性样本检出数 2 结果 2.1 胶体金免疫试纸检测限 从表1的结果可以看出，恩诺沙星及环丙沙星添加浓度为50、75、100pg/L时检测结果全为阳性，添加浓度为 25 ug/L时仅有一份恩诺沙星样品检测为阳性，因此本试纸条在牛奶中恩诺沙星的检测限为50 pg/L。 表1 胶体金免疫试纸检测限的测定 药物 添加浓度/(ug·L-) 10 25 50 75 100 - + + + - + + + 恩诺沙星 + + + + - - + + + - + + + 一 + + + + + + 环丙沙星 一 + + + - + + + - + + + 2.2胶体金免疫试纸特异性试纸条与喹诺酮类主要药物及其他类药物交叉反应率的结果如表2所示。测定的结果表明，胶体金试纸条与喹诺酮类药物中除恩诺沙星和环丙沙星外的其他喹诺酮类药物的交叉反应率均不到50%，与四环素、链霉素和阿维菌素不存在交叉反应率，因此胶体金免疫试纸能够特异性地检测恩诺沙星和环丙沙星。 表2 试纸条与喹诺酮类主要药物的交叉反应率 药物 交叉反应率/% 恩诺沙星 100.0 环丙沙星 95.0 氧氟沙星 <36.8 氟甲喹 <29.6 诺氟沙星 <15.6 二氟沙星 <10.2 达氟沙星 <9.8 四环素 <0.1 链霉素 <0.1 阿维菌素 <0.1 2.3胶体金免疫试纸稳定性 在空白牛奶样品中，按照25、50、75 pg/L三个浓度进行添加，每个浓度添加5份，用试纸条进行检测，试验结果如表3所示。结果表明，恩诺沙星试纸条在保存于2℃~8℃或者室温条件下，可以稳定放置12个月而不影响检测能力，说明该试纸条的稳定性良好，保存期可以长达1年。 表3 胶体金免疫试纸稳定性的测定结果 三 添加浓度 2℃~8℃ 25ug/L 50 ug/L 75 ug/L 25 ug/L 50 pg/L 75 pg/L 第0个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第1个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第3个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第6个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第9个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第12个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 2.4 假阳性率对50份LC-MS/MS确证的阴性牛奶用胶体金免疫试纸测定，结果如表4所示。结果显示50份阴性牛奶中仅有1份样本用试纸结果检测为阳性，通过计算得出，试纸条的假阳性率为98%。 表4 阴性牛奶样品测定结果 样品编号 结果 1#~10# - - - - - 11#~20# + - - 一 一 21#~30# - - - - - - - 31#~40# - - - - - - - - 41#~50# 一 2.5 假阴性率 按100 ug/L终浓度添加恩诺沙星至LC-MS/MS确证的60份阴性牛奶中，编号1#~60#；按100 pg/L终浓度添加环丙沙星至LC-MS/MS确证的60份阴性牛奶中，编号61#~120#，试纸的检测结果如表5所示。结果表明对120份 添加的牛奶样本检测结果均为阳性，通过计算得出，本试纸条的假阳性率为0，能够准确地检测出牛奶样本中的恩诺沙星与环丙沙星。 表5 阴性牛奶样品测定结果 样品编号 结果 1#~10# + + + + + + + + + + 11#~20# + + + + 21#~30# + + + + 31#~40# + + + + 41#~50# + + + 51#~60# + + + + 61#~70# + + + + 71#~80# + + + + 81#~90# + + + + 91#~100# + + + + + + + + + + 101#~110# + + + + + + + + + + 111#~120# + + + + + + + + + + 2.6 仪器比对 分别采用仪器方法和试纸条方法对50份盲样进行测定，阴阳性判断的临界值 为50 ug/L。经 LC -MS/MS 测定，50份样品中有45份为阴性样本，5份阳性(3#、21#、26#、38#、41#)。经试纸条测定，44份为阴性样本，6分为阳性样本(3#、5#、21#、26#、38#、41#)。试验结果表明，本试纸条与 LC - MS/MS检测阴性样本符合率为97.8%。 3 讨论 恩诺沙星属于小分子物质，采用竞争抑制法对其进行检测，在建立方法时应特别注意对胶体金颗粒的吸附量和包被抗原量的摸索。恩诺沙星单克隆抗体在进行金标时，运用分光光度计测定法和目测法来选择胶体金与抗体之间的最适比，以减少目测法时人为因素过多的干涉，使胶体金能与抗体最大限度的结合。 农业部的235号公告2规定了恩诺沙星在牛奶中的最高残留限量为100 pg/L，因此建立方法时必须考虑设定合适的检测限。抗原的包被量过高，会使试纸条的灵敏度降低；过低，会使在合格范围内的被检样品判为不合格。通常基层使用胶体金试纸作为初筛，筛选为阳性的结果，再用仪器进行确诊。如果灵敏度过高，不仅增加了检测机构的工作量，同时会造成牛奶生产者的损失。 公告同时也对牛羊的肌肉、脂肪和内脏组织中恩诺沙星的最高残留限量做出了规定，这需要在今后的工作中摸索动物组织中恩诺沙星的提取方法， (上接第11页) 加强对兽药经营单位及兽药使用单位的监督检查，对出现假兽药较多的经营单位依法吊销经营许可证，加快兽药 GSP 的实施，使兽药经营单位树立产品质量意识。同时，对出现较多假兽药的企业进行监督检查和飞行检查，核查生产企业的假兽药确认情况。 表2 2010年假兽药汇总表 假兽药 抽检 抽样 假兽药占抽样 批数 批数 批数 批数比例/% 第一季度 314 1496 1810 17.3 第二季度 937 3510 4447 21.1 第三季度 1137 4267 5404 21.0 第四季度 732 3807 4539 16.1 合计 3120 13080 16200 19.3 4.2 不合格产品中含量不合格所占比例较大 在2010年度1154批不合格产品中，含量不合格的产品共有517批，占不合格产品的比例为44.8%。其 ( 参考文献： ) ( [1] 姜利英，谢小品，崔光照，等.动物性食品中喹诺酮类药物残留检测方法的研究进展[].郑州轻工业学院学报，2008，4 (23)：1-4. ) ( 2] 董志远，赵晓凤，宫秀杰，等.牛奶中氟喹诺酮类药物残留量检测方法的研究叨.中国兽药杂志，2008，42(10)：14-16. ) ( 3] 李忠秋，马红，郭镇华，等.免疫胶体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展[.黑龙江畜牧兽医，2006，9：16- 18. ) ( [4] 范国英，陈永耀，王顺岗，等.链霉素快速检测试纸条的研制及其性能测定[.西北农业学报，2010，19(2)：40-44. ) ( [5] 刘恒，郑文杰，贺艳.胶体金免疫层析法快速检测组织样品中喹诺酮类药物残留[].食品研究与开发，2009，5：131- 134. ) ( [ 6] 李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002. ) ( [7] 吴永宁，邵 兵 ，沈建忠.兽药残留检测与监控技术[M].北京：化学工业出版社，2007. ) ( [8] Bassab C ， Syamal R . 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All rights reserved. http：//www.cnki.net 恩诺沙星(Enrofloxacin)与环丙沙星是属于喹诺酮类化学合成的抑菌剂， 广泛应用于畜禽和水产养殖中支原体和细菌性疾病预防与治疗， 但长期使用会造成组织中药物残留而影响人类健康， 因此对恩诺沙星和环丙沙星的检测分析具有良好的经济效益和重要的社会意义。国内外已有微生物法、 色谱法、 电化学法和免疫分析法研究的报道。本文应用制备的恩诺沙星的单克隆抗体(mAb)和胶体金免疫层析技术(GICA)研制出残留快速检测胶体金试纸， 以期为基层大规模的初筛提供快速、简便的检测方法。