MDCK(犬肾细胞)中MDCK(犬肾细胞)检测方案(酶 氨基酸)

MDCK(犬肾细胞)凋亡常用检测 MDCK(犬肾细胞)凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 一、MDCK(犬肾细胞)形态学变化 形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 二、生物化学变化 MDCK(犬肾细胞)的片段化 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。 2) 大分子合成 细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如我们实验室发现的TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。 根据细胞凋亡的形态学和生物化学变化，一般常用的检测方法包括：形态学检测，Annexin V 法，线粒体膜势能的检测，DNA 片断化检测，TUNEL 法，Caspase-3 活性的检测，TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析。 一、MDCK(犬肾细胞)细胞凋亡的形态学检测 1. 光学显微镜和倒置显微镜 a) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 b) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释，终浓度为 10 ug/ml。 DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用终浓度一般为 10 ug/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图 1)。 3. 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图 2)；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图 3)。Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。 将 Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 三、MDCK(犬肾细胞)线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用， 多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位 DYmt 的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA 断裂）出现之前，一旦线粒体 DYmt 崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、DiOC6(3)、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为 Rhodamine 123（1mM） 或终浓度为 DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C 平衡 30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。 四、MDCK(犬肾细胞)DNA 片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成 50~300kbp长的 DNA大片段, 或 180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯 DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使 DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。 1. 大分子染色体 DNA 片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为 50~300kbp 长的 DNA 大片段。 所有超过一定分子量大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的 50~300kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的 DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA 分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子量大小分开。 2. DNA Ladder 测定 细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。 3. 凋亡细胞 DNA 含量的流式细胞计分析 由于凋亡细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。 五MDCK(犬肾细胞) TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。 六、MDCK(犬肾细胞)Caspase-3 活性的检测 Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。 七、MDCK(犬肾细胞)凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明， 它是促进细胞凋亡的增强剂。 利用荧光素 （FITC） 标记的 TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象， 伴随着细胞核形态学的变化， 持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期 TFAR19 蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核 DNA 的片段化，提示 TFAR19 蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期 TFAR19 的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现 TFAR19 高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。 MDCK(犬肾细胞)凋亡常用检测 MDCK(犬肾细胞)凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。                 一、MDCK(犬肾细胞)形态学变化        形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。                二、生物化学变化 MDCK(犬肾细胞)的片段化        细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。        2) 大分子合成        细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如我们实验室发现的TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。                根据细胞凋亡的形态学和生物化学变化，一般常用的检测方法包括：形态学检测，Annexin V 法，线粒体膜势能的检测，DNA 片断化检测，TUNEL 法，Caspase-3 活性的检测，TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析。                 一、MDCK(犬肾细胞)细胞凋亡的形态学检测        1. 光学显微镜和倒置显微镜        a) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。        b) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。        2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜        一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。        常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。        Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释，终浓度为 10 ug/ml。        DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用终浓度一般为 10 ug/ml。        结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图 1)。        3. 透射电子显微镜观察        凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图 2)；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。                二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法）        磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图 3)。Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。 将 Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。        碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。                 三、MDCK(犬肾细胞)线粒体膜势能的检测        线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用， 多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位 DYmt 的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA 断裂）出现之前，一旦线粒体 DYmt        崩溃，则细胞凋亡不可逆转。        线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、DiOC6(3)、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。        方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为 Rhodamine 123（1mM）        或终浓度为 DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C 平衡 30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。                 四、MDCK(犬肾细胞)DNA 片断化检测        细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成 50~300kbp长的 DNA大片段, 或 180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯 DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使 DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。        1. 大分子染色体 DNA 片段的测定        细胞凋亡的早期,染色体断裂成为 50~300kbp 长的 DNA 大片段。 所有超过一定分子量大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的 50~300kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的 DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA 分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子量大小分开。        2. DNA Ladder 测定        细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。        3. 凋亡细胞 DNA 含量的流式细胞计分析        由于凋亡细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。                 五MDCK(犬肾细胞) TUNEL法        细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。        由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。                 六、MDCK(犬肾细胞)Caspase-3 活性的检测        Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。                 七、MDCK(犬肾细胞)凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析        TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明， 它是促进细胞凋亡的增强剂。 利用荧光素 （FITC） 标记的 TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象， 伴随着细胞核形态学的变化， 持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期 TFAR19 蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核 DNA 的片段化，提示 TFAR19 蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期 TFAR19 的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现 TFAR19 高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。