克鲁斯假丝酵母中应用检测方案

假丝酵母分类的常用方法 摘要：概述了假丝酵母属的建立和定义的演变以及分类进展，并介绍了在假丝酵母属分类中常用的一些方法。 酵母菌的分类发展非常迅速，从1952年的第一本酵母分类专著问世以来，到1984年又酵母分类专著第三版，酵母菌属的数量已由1952年的26属增加到56属，种的数量由160种增加到600种左右。1984年后属、种数量又有所增加。鉴定的常规方法与新技术也都有发展。假丝酵母属(Candida Berkhout)是酵母菌中最大的一个属，现包括200多种，约占目前已知酵母菌总种数的三分之一[1]。由于假丝酵母的经济重要性及其在整个酵母菌中占的比重，对该属的分类研究作为其他各方面研究的基础，一直是一个颇为活跃的领域。研究手段不断改进，分类系统不断更新。假丝酵母属的常规分类主要依赖于形态和生理特征。由于酵母菌主要以单细胞形式存在、可供考察的形态特征很有限，故其种级水平上的分类，主要以对糖类化合物的发酵和对碳、氮源化合物的同化能力。对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性为依据。然而，这些特征所表现的均是表型性状，难以反映种间的亲缘关系。在常规分类所测试的30—40项生理生化性状中，许多种间往往只存在一两项区别。而研究表明，有些生理生化性状常常是由单个可变基因控制的，因而是不稳定的。所以在常规分类中对只有一两项生理生化性状差异的相似种做出精确鉴定往往是困难的。目前假丝酵母分类除了细胞形态和行为水平的研究外，也发展了细胞水平，蛋白质水平与基因组水平的研究。借助各种技术的适当运用，对假丝酵母的亲缘关系有了更深入的了解。近10多年来该属的定义已经过两次重大修订[2]。下面对该属的分类研究进展及分类方法作一介绍。 1、假丝酵母属的建立及其定义的演变 假丝酵母属是1923年建立的[3] ，Yarrow和Meyer把球拟酵母属(Torulopsis Berlese)与假丝酵母属合二为一，把前者变为后者的异名，对假丝酵母属的定义作了较大的修订，使这样一个本来就不自然的类群更加异源化，在同一属内包括了子囊菌和担子菌两类酵母的无性型。因此随后就有人依靠下述分类技术的进步对假丝酵母属进行了清理工作。 1)用透射电镜对酵母菌细胞壁的超微结构进行观察的结果发现担子菌酵母的细胞壁为多层结构，而子囊菌酵母的细胞壁则为双层结构．担子菌酵母为全壁芽殖型，而子囊菌酵母则为内壁芽殖型。 2)在细胞壁水解产物单糖组成上。子囊菌酵母与担子菌酵母也有明显差异，子囊菌酵母以甘露糖占优势，不含鼠李糖，岩藻糖和木糖；担子菌酵母则可分为两类：一类含有木糖及少量的甘露糖，另一类含有岩藻糖和／或鼠李糖及相当数量的甘露糖。 3)子囊菌酵母与担子菌酵母在细胞壁超微结构及其水解物单糖组成上的差异，与DBB(Diazonium Blue B Salt)颜色反应和尿素酶试验具有很好的对应性，前者均为阴性而后者均为阳性。这样，子囊菌酵母与担子菌酵母就可以通过简单的颜色反应而区别开来。 Weijman等主要根据上述相关性特征对假丝酵母属进行了重新定义，把假丝 Weijman等主要根据上述相关性特征对假丝酵母属进行了重新定义，把假丝酵母属局限于只包含子囊菌酵母无性型的范围内．把原来包括在该属内的属于担子菌酵母无性型的种分别移入经过相应修订的红酵母属(Rhodotorula Harrison)和隐球酵母属(Cryptoccus Kutzing)中，从而使假丝酵母属多少呈现为一个较为自然的分类群。但是，根据目前这一最新定义，假丝酵母属仍存在一定程度的异源性，表现在该属内泛醌(CoQ)系统的不均一性，包括具Q—6至Q—9四种类型的种[４]。 2、假丝酵母的组织化学和免役学分类 2.1脂肪酸的组分分析 近二十年来，脂肪酸在微生物分类中的作用越来越得到微生物分类学者的注意。把全细胞脂肪酸用于酵母菌分类主要是八十年代初才开始的，先后有人对假丝酵母属Candida（Gunasekaran & Hughes,1980）等类属酵母菌的脂肪酸作了测定，并根据脂肪酸数据对这些酵母菌分群，提出一些用脂肪酸进行快速鉴定的方法。 史国利等[５]利用脂肪酸对假丝酵母进行了分类，从结果看，根据脂肪酸对菌株的分类结果与表观性状聚类分析的结果类似，这说明脂肪酸分析作为探索酵母菌系统分类关系的辅助方法是可行的。但脂肪酸的差异只是菌株间整体差异的一部分，只对脂肪酸的分析不能完全反映菌株之间的亲绿关系，按照数值分类学的观点，更科学的分析方法应是将包括脂肪酸性状在内的多种在一起进行多元统计分祈，但这在技术上有许多困难，有持进一步研究。 2.2辅酶系统 辅酶Q作为线粒体上电子转移系统的一部分，广泛存在于各类真菌当中。不同种类的真菌都有一特定的辅酶Q，假丝酵母属是一个无性型的形式属，Yamada和Kondo(1972)发现这个属内的辅酶Q系统很不均一，包括Q—6至Q—10五种类型的种，反映出该属为一极端异源化的类群。1988年Weijman等对该属进行了重新界定，移去了CoQ为Q—10的属于担子菌酵母无性型的种，使该属只包括属于子囊菌的无性型酵母菌。但重新界定后的假丝酵母属在整个酵母菌中仍是一个最不自然的属。包括Q-6至Q—9四种辅酶Q类型。由于在有性型酵母菌中，CoQ类型具有属内专一性，因此该数据对于建立有性型一无性型关联及假丝酵母属的重新划分，使其更趋于成为一个自然的分类群，具有重要的参考价值。白逢彦等[4]根据辅酶Q将29种37株的假丝酵母分为Q-6、Q-7、Q-8三组。由于在有性型酵母菌中，辅酶类型具有属内专一性，因此该数据对于建立有性型一无性型关联及假丝酵母属的重新划分，使其更趋于成为一个自然的分类群，具有重要的参考价值。 2.3 免疫学及其它化学分类方法的应用： Tsuchia等从假丝酵母属的几个种着手开始了血清学方法在酵母菌分类中的应用研究．分别于1965年和!974年对其研究结果作了总结，并提出了一个与传统分类完全不同的分类系统Spencer和Gorin用核磁共振技术对假丝酵母属作了专门的研究。他们的某些研究结果，如指出了用能否产生假菌丝来区分假丝酵母属和球拟酵母属的不可靠性，对该类酵母菌的分类学研究产生了积极的影响。 假丝酵母属的分子分类 3.1 DNA碱基组成：大量研究表明，假丝酵母属内种的GC含量变化范围在30％一60%之间[6-7]，属内差异高达30％，是所有酵母茵属内GC值差异最大的，进一步反映了这个属的异源性。因为从已测定的酵母菌各属内GC含量来看，属内差异多在10%之内[8]。用GC值可将假丝酵母周内的种分为两组：一组的GC值低于50％、伴随着尿素酶反应阴性；另一组的GC值高于50％、尿素酶反应则为阳性。这两组分别为子囊菌酵母和担子菌酵母的无性型。DNA碱基组成的分类学意义主要是否定性的。若两株酵母菌间的GC值差异超过1.0％一1.5％(浮力密度法)或超过2.0％一2.5％(热变性法)，则表明二者不可能为同一种[8-9]。但具有相同或相近似值的菌株却不一定为同一种或具有相近的亲缘关系。 3.2 DNA一DNA (或DNA—RNA)同源性：DNA同源性或相关性能够比DNA碱基组成更精确地反映菌株间DNA碱基序列的相似程度，因此比后者具有更大的分类学价值，尤其适用于GC值相近的菌种间的分类。Price等[9]根据他们的研究结果建议DNA同源性在80％以上的菌株应视为同一种。但DNA同源率在 60％一80％之间的菌株亦常在以后的研究中遇到。因此目前酵母菌分类学者一般认为，DNA同源率在80％以上的菌株可以确认为属于同一种，在65％一80%之间的代表同一种内分化较远的菌株，在20％以下则被视为代表不同的种。 3.3．rRNA／rDNA序列分析：核糖体RNA(rRNA)或其模板核糖体DNA(rDNA)的序列分析正被广泛地运用于酵母茵的系统学研究中。Barans等[]Hendricks等Ohkuma等分析了部分假丝酵母苗的小亚基侧rRNA／rDNA序列并据此构建了系统树。Suzuki等测定了20种细胞水解液中含半乳糖的假丝酵母茵的小亚基侧基因序列，并与该属内部分不含半乳糖的种进行了比较分析．结果发现这两组菌在系统树上形成了两个独立的分枝，表明酵母细胞水解液中单糖组成可以反映亲缘关系。 Kuryzman和Robnett[]分析了假丝酵母属内所有已知种的大亚基rRNA基因(LSUrDNA)5’端的部分碱基序列(约600bP)，并具此研究了该属内种间亲缘关系．结果表明这一区域具有足够的多变性、从而可以将假丝酵母属内的所有种清楚地区分开，但种内差异却不超过2个bp。而且这一区域内种间序列差异与DNA同源性具有很好的对应性。因此他们认为该段序列可以作为假丝酵母菌种间鉴别的可靠依据。 白逢彦等[11]对根据常规形态和生理生化性状难以确定分类学地位的8株假丝酵母菌，进行了以大亚基(26s)rDNA中D1/D2区域(约500—600bp)的碱基序列分析为依据的分子分类学研究。根据系统树上所显示的供试菌株与假红酵母属及相关子囊菌酵母己知种的亲缘关系，以及与最近缘种模式菌株D1／D2区域序列的相似性比较，确定了各个菌株的归属。本研究也显示了DNA序列分析在假丝酵母菌快速鉴定中的优越性。 3.4 脉冲电泳核型分析：利用一个新发展起来的电泳技术，即脉冲电场凝胶电泳(pulsed field gel electrophosis)．简称PEGE技术，可以在琼脂糖凝胶中分离 完整的酵母染色体DNA分子、从而估测酵母细胞染色体条数及其大小。这一被称为脉冲电泳核型分析或分子核型分析的技术已被越来越多地应用于酵母菌的分类学研究中[]。在假丝酵母属的分类中也已经做了许多成功的研究工作 Iwaguchi等和Doi等分析了C.alcibans等8种临床常见病原假丝酵母菌的电泳核型，并估算出了每个种的平均染色体条数及整个基因组大小．各个种内不同菌株间存在染色体条数及大小的变化，但其变化幅度远小于种间差异，每种都具有独自的种内特异性核型。Lee等[]在用CHEF脉冲电泳系统比较分析一些假丝酵母菌模式菌株的电泳核型时发现具有相似或相同核型的种间也具有很高的DNA同源性．白逢严[12]分析了克鲁斯假丝酵母(C.lausci)，郎比可假丝酵母(C.lambica)和粗状假丝酵母(C.valida)的模式菌株的电泳核型，发现这三种表型性状相似的假丝酵母菌却具有互不相同的染色体DNA分子带型，为其分类学研究提供了更可靠的鉴别依据。