乳制品及特殊膳食中营养成分检测方案

Best ValueGuaranteed Product QualityInnovation to Benefit Customers Agela Technologies 婴幼儿奶粉中双氰胺的检测 HPLC-UV 法和 LC-MS/MS 法 应用编号：AF10045 1.样品：新西兰婴儿配方奶粉(0~6个月) 表1双氰胺的信息 名称 结构式 分子量 CAS 双氰胺 NH NNH2 84.08 461-58-5 2.样品提取及净化 称取1g试样于50 mL 具塞离心管中，加2mL水，涡旋 30s， 加2mL乙涡涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10 mL的提取液。以4000 r/min 离心 5 min，将全部上清液加入新一代 Cleanert"MAS-QuChERS 管中(500mg/ 15mL)， 将 MAS 管上下晃动 30s， 然后涡旋 30s后，8000r/min 离心5 min，取全部上清液(约10mL)于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1mL 乙腈-水混合溶液(97：3)复溶，过 0.22 um滤器，待测。 注：a.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； b.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果；c.净化液氮气吹干后，如发现有少量油油，可采用1mL乙腈：水(97：3)混合溶液复溶，之后加入1 mL正己烷(色谱纯)液液萃取，取下层溶液过0.22pm 微孔滤膜，进样检测。 图1净化液氮吹后 图2乙腈复溶 3.检测方法 3.1高效液相色谱法 色谱柱： Venusil HILIC(5um， 100A， 4.6×250mm)； 流动相：10mmol/L乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=3：97； 波长：220mm；进样量：10uL；柱温：30℃； 流速：0.8mL/min。 注：本实验选用的奶粉经过净化后，按10 mmol/L 乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=15：85液相条件，有一个杂质与双氰胺完全重合，经实验条件优化后，确定流动相条件为 10 mmol/L 乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=3：97，双氰胺保留时间为9.3 min，可以和杂质完全分离。 3.2液相色谱串联质谱法 色谱柱： VenusilHILIC 5 um， 100 A， 2.1×150mm；流动相： A：0.5 mmol/L乙酸铵(pH=4.0)B：乙腈；进样羊： 10uL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。 表2流动相梯度程序 时间(min) A% B% 0 10 90 0.4 50 50 1.8 50 50 1.9 10 90 7 10 90 *备注：本文曾尝试过多种 C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于 LC-MS/MS；也曾尝试过 MERCKZIC-HILIC 柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基基胺的 Venusil HILIC 柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。 质谱条件： 质谱仪： API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测； CAD： 8.00；CUR： 20.00； GS1：60.00；GS2：50.00； IS： 5500.00；TEM： 600.00。 表3双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/68.1 71 10 41 6 85.1/43.1 71 10 41 6 4.结果与讨论 4.1高效液相色谱法 图3双氰胺 10 pg/mL 标准溶液的液相色谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 0.5ug/g， 1ug/g， 2ug/g， 5.0ug/mL 和 10pg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4： 表4双氰胺线性方程和定量限(HPLC法) 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限 (S/N=10) 双氰胺 5.57min Y=108.16X+27.827 0.9971 0.5ug/g 准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5 表5 0.5 pg/g 添加回收实验结果(HPLC法) 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.3% 85.5% 89.1% 85.63% 3.97% 图4奶粉 0.5 ug/g添加谱图 图5奶粉空白谱图 4.2LC-MS/MS法 图6双氰胺 10 ng/mL 标准溶液质谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品 50 mg 于50 mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 5ng/mL， 10ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL和200ng/mL 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6： 表6双氰胺线性方程和定量限(LC-MS/MS法) 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限(S/N=10) 双氰胺 3.15min Y=3859.1X+23694 0.9900 2ng/g 准确度和精密度 选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。 表7 10 ng/g 添加回收实验结果 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.5% 83.5% 89.3% 85.2% 4.31% 图7婴幼儿奶粉空白质谱图 图8婴婴儿奶粉 10 ng/g 添加水平的质谱图 5.订货言息 产品名称 规格包装 订货 新一代MAS-QuChERS-双氰胺净化管(填料量加大，更适合婴幼儿奶粉等 复杂样品) 500mg/15mL，50支/包 MS-SQA02 MAS-QuChERS-双氰胺净化管 100mg/2mL，50支/包 MS-SQA01 Venusil HILIC液相色谱柱 4.6×250 mm，5 um，100 A VH952505-0 2.1×150 mm，5 um，100 A VH951502-0 针式过滤器(Nylon) 0.22um，直径13mm，200/pk AS021320 一次性注射器，无针头 5 mL，100/pk ZSQ-5ML 双氰胺对照品 500mg /瓶，含量≥99.0% DCD-0001 1g/瓶，含量≥99.0% DCD-0002 离心管 50 mL，带螺纹盖，25个/包 LXG0050 1.5 mL 样品瓶 短螺纹透明带书写 32×11.6 mm， 100/pk 1109-0519 1.5mL 样品瓶盖 9mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色PTFE 隔垫，45. Shore A 1.0mm，100/pk 0915-1819 乙腈 4×4L/箱 AH015-4 本手册所有应用均可在博纳艾杰尔官方网站以应用编号搜索下载! www.agela.com.cn—