食用油、油脂中农兽药残留检测方案

分析方法验证 www.agilent.com/chem/cn 液相色谱/离子阱质谱和飞行时间质谱分析橄榄油中的特丁津除草剂 Imma Ferrer and E. Michael ThurmanUniversity of Almeria，04120 Almeria， Spain 摘要 本应用摘要介绍了液相色谱/离子阱质谱和飞行时间质谱对橄榄油中的特丁津进行定性定量分析。方法详细介绍了样品处理，包括液-液萃取和用氨基硅胶的基质分散固相萃取法。最后的样品净化采用 Florisil 硅土小柱，用乙腈洗脱溶质。液相色谱/离子阱质谱的MS/MS 模式采集特征离子 m/z 174。而利用液相/飞行时间质谱进行质子化分子离子([M+H]* m/z230)精确质量数分析，同时得到碎片的精确质量数和特丁津中存在的特征同位素分布。对于飞行时间质谱测得的质量精度小于2 ppm。此方法具有高灵敏度，线性好及精度高、准确性好、基质作用小的优点。此方法还研究了方法检出限。所以，液相/离子阱质谱和飞行时间质谱可以作为橄榄油中特丁律的常规方法。 引言 橄榄油是地中海国家最普遍的食品。由于橄榄油对人的健康有益，所以越来越来得到大世界的重视。新鲜橄榄油是直接从橄榄树的果实压榨，中间除了机械和物理加工之外，没有任何的处理以保证橄榄油的质量。在地中海国家(希腊，西班牙和意大利)使用的农药主要是除草剂和杀虫剂。尽管除草剂主要是施于土壤中，，一些残留农药存留在植物中，导致橄榄被污染。结果一些农药残留会存在于橄榄油中。欧盟和食品法典以及联合国世界粮农组织都规定了橄榄和橄榄油中农药残留的最大限量。现在，橄榄和橄榄油中各种农药残留的法规正在被更新而且比以前更加严格[1]。这些法规迫使分析实验室使用灵敏度和选择性更高的技术以满足食品如食用油的法规要求。食用油的基质非常复杂，含有大量的脂肪，在分析之前需要样品的提取过程。 多残留分析的样品净化方法根据样品而不同，而且也有几种分析方法检测橄榄油中的农药残留。其中常见的方法是气相色谱法，样品前处理一般先用液液萃取或凝胶过滤将小分子和大分子的脂肪化合物，如甘油三酸脂[2，3]分离。气相方法分析油类样品中的农药残留必须去除大分子量的脂肪化合物，以保证气相色谱的正常运行。最近报道了使用基质扩散固相萃取净化，然后用气质联用和离子阱质谱技术检测食品中的三嗪和有机磷农药的分析方法[4]。在本文中，介绍了液相/离子井质谱和液相/飞行时间质谱技术检测橄榄有一种常见的农药残留，特丁津。 实验方法 橄榄油提取 基质固相分散方法用于橄榄油中的特丁津提取。在进行基质固相分散之前，先用液液预提取。 1.液-液提取： -在100毫升的分液漏斗中，取橄榄油5克(约5.5 mL) 与15 mL 石油醚混合，用乙腈饱和。采用两部液-液萃取过程。 ( 一 25毫升乙腈 一 饱和石油醚加入到橄榄油中。将分液漏斗剧烈震荡3分钟，乙腈与石油醚分 层。 ) 另外10毫升乙腈饱和石油醚加入到石油醚的提取物液中。将分液漏斗剧烈震荡3分钟。乙腈与石油醚分层，将乙腈与前一次的乙腈混合。 -1最后，7毫升乙腈提取液转移至10毫升的试管中，浓缩至2毫升。剩下的2毫升转移至玻璃研钵中进行基质固相分散净化。 2.基质固相分散净化(MSPD)： -将2克的氨基吸附剂 (Bondesil-NH2，40微米粒径， Varian)与上面的2毫升乙腈萃取液混匀，直到出现细小的颗粒。进行固相萃取。 -混合物转移至装有2克 Florisil 硅土的小柱上(12ml Bond-Elute 小柱)。小柱连接在真空上，调节流速在3 ml/min 左右。 -用5ml 的乙腈洗脱两次。最后的洗脱液吹干。再用1：1的乙腈：水定容。 -在1进样之前，用0.45微米的 PTFE 膜过滤(Millex FG， Millipore)，最然后进样进行液质分析。 使用基质固相分散净化 (MSPD)法，橄榄油样品中特丁津的回收率大于96%，方法相对标准偏差(RSD)(n=5)小于6%。 液相色谱条件 液相泵采用1100二元泵 进样体积： 50微升，采用1100标准自动进样器 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8， 4.6 mmx150 mm， 5pm，部件号993967-906流动相：A=乙腈；B=0.1%甲酸水溶液 梯 度 ： 10%A保持5分钟，在25分钟内，线性梯度变为100%A， 流速 0.6 ml/min 质谱条件(MS) LC/MSD TOF 离子源： ESI正离子模式 毛细管电压： 4000 V 雾化器压力： 40 psig 干燥气： 9 L/min 干燥气温度： 300°C 碰撞电压： 190V 锥孔电压： 60V Oct DC1： 37.5V Oct RFV： 250V 参比离子： m/z 121.0509与922.0098 分辨率： 9500±500@m/z 922.0098 扫描范围： 50-1000 m/z 参比喷雾器A： 恒流模式 Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 方法 LC/MSD Trap 条件与 LC/MSD TOF的条件一致. 液相泵： HP 1100 进样体积： 50微升 色谱柱： ZORBAX Eclipse XDB-C-8， 4.6 mmx150 mm， 5 pm， 部件号993967-906 流动相： A=乙腈(ACN) B=0.1%甲酸水溶液 梯度： 10%A保持5分钟，在25分钟内，线性梯度变为100%A， 流速 0.6 ml/min LC/MSD Trap ESI (正模式)： Capillary 3200V 雾化气：干燥气： 40 psig 9 L/min，温度为300°C 毛细管出口： 70V 锥孔： 60V 离子阱积聚： 50000，最大积聚时间 200ms 结果与讨论 液相/离子阱质谱和液相色谱/飞行时间质谱分析特丁津 由于存在大量的基质，橄榄油是最难分析的样品之一，若使用全扫描模式，将会产生很强的干扰峰。因此，对于离子阱质谱，可以采用 MS/MS 模式来提高信噪比。又于特丁津，0.8V的碰撞电压是最佳的条件，主要的特征离子是 m/z174(丢失56 amu)。 图1. 在离子阱上， MS/MS模式的条件下，橄榄油样品添加特丁津 (0.025 mg/kg) 的特征离子的提取离子流色谱图。下图是特丁津的二级质谱图 除了离子阱质谱之外，也尝试了液相色谱/飞行时间质谱技术用于橄榄油中的特丁津的分析。采用源内碰撞诱导解离(In-source CID) 产生碎片。由于在飞行时间质谱获上可以获得精确质量数的分子离子峰和碎片离子，因此更容易进行结构的确认。在三个碰撞电压，160V， 190V和230V的条件下，特丁津的准分子离子峰和特征碎片离子的相对丰度总结在表1中。为了保证足够的定量灵敏度(一般是用质子化的分子 表1. 碰撞电压对解离效率的影响 m/z离子 相对丰度 160V 190V 230V 230[M+H]+ 100 100 20 174[M+H-C4H：]+ 5 30 100 离子峰)和定性质谱信息，最后选择190V的电压。橄榄油中添加的特丁津的分子离子峰和特征碎片的精确质量数参见表2。 表2. 液相/飞行时间质谱上得到的橄榄油中特丁津分子离子峰及主要碎片的精确质量数。特丁津的添加水平是 0.025mg/Kg，碰撞电压是190V 元素组成 离子 理论质量 测量质量 偏差 mDa ppm CgH16N35CI M+H1 230.1167 230.1168 0.1 0.4 CgH16NsCI 232.1137 232.1134 -0.3 -1.5 C5HgN35CI [M+H-C4H8]+ 174.0541 174.0542 0.1 0.6 C5HgNCI 176.0511 176.0511 -0.05 -0.3 在优化的碰撞电压条件下得到的特丁津的分子离子峰和特征碎片离子信息可以用于特丁津的确认，尤其是含氯原子的分子量的同位素分布。如图2所示，特丁津含有一个氯原子。保留时间，准确质量数及同位素分布可以确认其结构并且该分子中只含有一个氯原子。 图2. 添加0.025 mg/kg 特丁津的橄榄油样品的液相/飞行时间质谱的总离子流图。m/z 230离子的提取离子流图和其相应的质谱图 为了使分析方法能用于高油脂基质样品中的特丁津的分析，对整个分析方法进行了评价。利用 MSPD 萃取法制备的橄榄油样品为基质制备校正曲线。在0.005至0.5 mg/Kg 的范围内，进行有基质条件下的七点校正。利用离子阱质谱，对 m/z 230 离子进行MRM 模式的定量分析。对于飞行时间质谱，以分子离子峰(质谱窗口的宽度为 0.1Da)为定量离子。图3为在飞行质谱上得到有基质和标准溶液条件下的校正曲线。 检测限的测试条件为，在有基质的条件下，得到信噪比是3时的进量量。分析结果如表3所示。结果表明，得到的检测限远远低于法规要求的最大残留限量。飞行时间质谱可以使用窄质量窗口用于定量分析，而且可以得到更高的信噪比，最终得到更低的检测限。上述结果显示，采用MSPD 样品处理方法和液相/飞行时间质谱技术适用于含高脂肪基质样品中的农药残留分析。 浓度(mg/kg) 图3. 在液相色谱/飞行时间质谱上，橄榄油基质和标准溶液的校正曲线 表3. 离子阱液质和飞行时间质谱技术检测橄榄油中特丁津的方法条件 结论 浓度范围 线性 检测限 RSD (%) 方法 (mg/kg) (R) (pg/kg) n=5 LC/ITMS 0.005-0.5 0.991 0.2 5.5 LC/TOFMS 0.005-0.5 0.995 1 2 橄榄油样品的分析 为了验证方法的有效性，将上述方法应用于实际样品。如图4所示，在橄榄油中发现微量的特丁津， m/z 230的提取离子流图。这是一个真实的样品，将液相/飞行时间质谱技术用于橄榄油中的微量农药残留化合物，选择性可以通过飞行时间质谱的分辨率来提高。图中所示为质量窗口在 0.05 Da 的条件下，信号离子m/z 230与类似分子量背景的分辨情况。可以使用氯原子的特征同位素分布对特丁津进行定性定量分析。 液相色谱/离子阱质谱和液相色谱/飞行时间质谱用于橄榄油的农残的定性和定量分析。对于离子阱质谱，采用 MS/MS 模式，对特征离子 m/z 174 进行定量分析。对于飞行时间质谱，可以利用分子离子的准确质量数得到的实验分子式和氯原子的特征同位素分布对橄榄油中的微量特丁津进行确认。质量数精度误差一般小于2 ppm。离子阱液质和飞行时间质谱分析方法灵敏度，线形，精密度，基质干扰和检测限适用于橄榄油中特丁津的常规检测。 ( 参考文献 ) ( 1. P roposal for a Regulation of the European Parliament and of the Council on maximum residue levels of pesticides in products of plant and animalorigin，COM/2003/0117/final- COD2003/0052*/；www.europa.eu.int/pol/food/indexes.htm ) 2. Ch. Lentza-Rizos，E. J.Avramides， and F. Cherasco，(2001) J. Chromatogr. A 912： 135-142. 3..，J.J. Vreuls，R. J.J. Swen， V. P. Goudriaan，M.A. T. Kerkhoff， G. A. Jongenotter， andU. A. Th. Brinkman， (1996) J. Chromatogr. A 750：275-286. 4.C. Ferrer， M. J. Gomez，J. F. Garcia-Reyes，I. Ferrer， E. M. Thurman， and A. R. Fernandez-Alba，(2005)J. Chromatogr. A 1069： 183-194. 致谢 感谢 Amadeo Fernandez-Alba， Juan-Francisco Garcia-Reyes and Carmen Ferrer from the Department of Hydro-geology and Analytical Chemistry， University of Almeria的帮助、意见和分析支持。 安捷伦联系人：Jerry Zweigenbaum 如需了解更多信息 如需要了解我们的产品及服务更多信息请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 ( 安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的有关损失不承担责 任。 本资料中所涉及的信息、说明和指标， 如 有变更，恕不另行通知。 ) ◎安捷伦科技公司，2005 中国印刷2005年8月18日5989-3573CHCN ...Agilent Technologies