中药中主要物质含量分析检测方案

深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909邮箱：water1102@163.com 网址：www.globetechchina. com·880. 。881· 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014， 45(9) 顶空毛细管气相色谱法测定泽泻醇提取物中的溶剂及树脂残留物 程志红，宋定中，侯惠民*，袁杰，郝五四 (中国医药工业研究总院药物制剂国家工程研究中心，上海201203) 摘要：建立了顶空毛细管气相色谱法测定泽泻醇提取物中的8种溶剂和树脂残留物，采用Rtx-5型毛细管色谱柱测定乙酸乙酯和正正烷，用 Stabilwax-DB毛细管色谱柱测定苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯。使用FID检测器，以N，为载气，程序升温。8种溶剂分离良好，乙酸乙酯在24.88~734.7 ug、正己烷在2.05~20.5ug、苯在0.04~0.80ug、甲苯在0.05~0.84 ug、对二甲苯在0.03~0.85 ug、邻二甲苯在0.04~0.87 ug、苯乙烯在0.03~0.91 ug、二乙烯苯在0.09~0.91 ug范围内线性关系良好。乙酸乙酯和正己烷的回收率为112.02%和91.65%， RSD 小于3.45%；其他6种树脂残留的回收率为85.05%~96.32%， RSD 小于5.20%。 关键词：泽泻醇提取物；溶剂残留；树脂残留； 气相色谱；测定 中图分类号：0657.7*1 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2014)09-0880-03 Determination of Solvent and Resin Residues in Alisol Extract byHead-space Capillary Gas Chromatography CHENG Zhihong， SONG Dingzhong， HOU Huimin*， YUAN Jie， HAO Wusi (National Pharmaceutical Engineering Research Center， China State Institute ofPharmaceutical Industry， Shanghai 201203) ABSTRACT： A head-space capillary GC method was established for the determination of ethyl acetate， n-hexaneand six kinds of resin residues in alisol extract. A Rtx-5 column was used for the determination of ethyl acetate andn-hexane， while a Stabilwax-DB column was used for the determination of benzene，toluene，p-xylene， o-xylene， styrene，and divinylbenzene. FID detector was used with temperature programmed control using nitrogen as the carrier gas. Eightresidual solvents were separated completely. The calibration curves for the above eight compounds were linear in theranges of 2.05 -20.5 pg， 24.88-734.7 pg，0.04-0.80 pg， 0.05 -0.84 pg， 0.03-0.85 pg， 0.04-0.87 pg， 0.03-0.91 pgand 0.09-0.91 ug，respectively. The recoveries of ethyl acetate and n-hexane were 112.02% and 91.65%， with RSDs lessthan 3.45%， while the recoveries of the others were 85.05%-96.32%， with RSDs less than 5.20%. Key Words： alisol extract； solvent residue； resin residue； gas chromatography； determination 大孔吸附树脂在中药和天然药物活性成分和有效部位的分离纯化中应用广泛。一般采用苯乙烯等原料合成，通过加入致孔剂制得。大孔吸附树脂在使用前须经酸、碱、醇反复洗脱，尽可能除去残留 ( 收稿日期：2014-03-12 ) ( 基金项目：上海市科委中药现代化专项(12401901300) ) ( 作者简介：程志红(1979-)，男，副研究员 ， 博士研究生，专业方向：中药新药研发及新剂型。 ) ( Tel： 0 21-51320211 ) ( E-mail： chengzh@nperc.com ) ( 通信联系人：侯惠民(1940-)，男，中国工程院院士，研究员，从事新型药物制剂和释药系统的开发、工程化及产业化研究。 ) ( E-mail： houhm@nperc.com ) 溶剂，但在用于分离纯化中药活性成分时，由于采用不同pH 值和不同浓度的乙醇进行洗脱，可能将残留的致孔剂、聚合物原料等随活性成分洗脱，因此，应进行检测，制订合理的限量并列入质量标准。 泽泻醇提取物具有降血脂和抗动脉粥样硬化作用，在制备过程中，采用乙醇与乙酸乙酯(1)-石油醚混合溶剂进行连续萃取，可有效将总三萜类化合物的纯度提高到50%以上，满足中药五类新药的注册申报要求。因此，必须检测泽泻提取物中1和石油醚的溶剂残留。在精制过程中，一般采用大孔吸附树脂色谱法除去杂质。据此，本研究建立了顶空 深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909 邮箱：water1102@163. com 网址：www.globetechchina. com中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014， 45(9) 毛细管气相色谱法，采用 Rtx-5和 Stabilwax-DB毛细管色谱柱，分离并测定泽泻醇提取物中的1、正己烷(2)的残留以及苯(3)、甲苯(4)、对二甲苯(5)、邻二甲苯(6)、苯乙烯(7)和二乙烯苯(8)等树脂残留物，并通过测定3批中试样品，结合人用药品注册技术规定国际协调会议(ICH)残留溶剂指导原则确定上述各残留物质的限量标准。 1仪器与试药 GC-2010型气相色谱仪(日本Shimadzu 公司)；AOC-5000 型顶空进样器， FID 检测器和 ABT 120-4M型电子天平(德国KERN公司)。 泽泻醇提取物(本室自制，批号20131018、20131022和21031026)；石油醚、1、2、4和8均为分析纯，3、5、6和 DMF 均为GC纯，7为化学纯。 2方法与结果 2.1 溶液配制 供试品溶液：精密称取泽泻醇提取物 200 mg，置25 ml量瓶中，加50% DMF溶液溶解并定容，精密吸取 10 pl置顶空瓶中，加热到90℃，顶空进样1ml。 对照品贮备液Ⅰ：分别精密称取1、2适量，加50%DMF 溶液稀释成浓度为25 和2 pg/ml 的1、2溶液，摇匀，作为对照品贮备液Ⅰ；另同法配制浓度为 250 ug/ml 的1贮备液。 对照品贮备液Ⅱ：分别精密称取3、4、5、6、7和8适量，加50% DMF 溶液稀释成含3~8各40 ug/ml的溶液，摇匀，即得。 2.2 色谱条件和系统适用性试验 1、2的测定：L：色谱柱 Rtx-5毛细管柱(0.25 mmx30 m， 0.25um)；载气氮气；流速0.45 ml/min；检测器氢火焰离子化检测器(FID)；程序升温初始温度30℃，保持8 min， 以2℃ /min 升至40℃，再以30℃/min升至200℃；尾吹氮气流速30 ml/min，氨气40ml/min， 空气400 ml/min；顶空进样90℃预热20 min； 进样量1ml；分流比1：30。 3~8的测定：色谱柱 Stabilwax-DB毛细管柱(0.25 mmx30 m， 0.25um)；载气氮气；流速1.89 ml/min；检测器 FID；程序升温初始温度 40℃，保持3 min， 以8℃/min 升至80℃，保持5 min，继续以10℃ /min 升温到200℃；顶空进样90℃预热20 min； 进样量1ml；分流比1：5。其中8共4个峰，按峰面积和计算。 上述色谱条件下，8种溶剂的典型色谱图见图1，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，分离良好。 A： 1、2对照品溶液， B： 3~8对照品溶液1-1；2-2；3-3；4-4；5-5；6-6；7-7；8-8； 9-DMF 图1典型色谱图 Fig.1 Typical Chromatograms 2.3 线性试验 精密量取对照品贮备液Ⅰ1、2、4、6、8和10ul， 另取1贮备液2和3ul置20 ml顶空瓶中，90℃加热20 min，进样1 ml， l1， 以进样量m 对峰面积A进行线性回归，计算线性方程。精密量取对照品贮备液Ⅱ，以50% DMF溶液分别稀释10、20、40、60、80、100倍，精密吸取1p.l注入20 ml顶空进样瓶中，90℃加热20 min， 进样1ml，以进样量m对峰面积A进行线性回归，计算线性方程。取低浓度对照品溶液逐步稀释，按“2.2”项下色谱条件测定，分别计算1~8的最低检测限(LLOD)和最低定量限 (LLOQ)， 结果见表1. 表1l 回归方程、LLOD和 LLOQ结果 Tab.1Regressive Equations， LLODs and LLOQs 有机溶剂 回归方程” 线性范围/pg LLOD/ng LLLOQ/ng A=4616m-27 855 24.88~734.7 167 557 2 A=2 637m+274 2.05~20.5 149 3 A=55720m+1739 0.04~0.80 4 A=53 726m-48 0.05~0.84 5 A=48 003m-512 0.03~0.85 10 6 A=49 367m-356 0.04~0.87 13 A-49 923m-361 0.03~0.91 9 A=47 475m-207 0.09~0.91 30 注："7>0.996 深圳市高比科技有限公司联系人：：水先生电话：：13810737909 2.4 精密度和回收率试验 取对照品贮备液Ⅰ和Ⅱ按“2.2”项下条件连续进样6次，1和2峰面积的 RSD 为4.62%和2.92%，树脂旨留物3~8峰面积的 RSD 分别为1.44%、1.31%、1.13%、1.03%、1.10%和1.47%。取已知8种残留物含量的泽泻醇提取物适量，加对照品贮备液Ⅰ或Ⅱ1pl，平行配制6份供试品溶液，进样测定，记录1~8的峰面积，计算得各溶剂的平均回收率分别为91.65%、112.02%、96.32%、88.07%、85.93%、86.72%、85.05%和91.66%，1、2的 RSD<3.45%， 3~8的RSD<5.20%。 2.5样品测定 分别取对照品贮备液Ⅰ、Ⅱ和3批供试品溶液进样测定，照中国药典一部2010年版附录ⅥE的外标法计算供试品中的溶剂和树脂残留量。各批提取物中均未检出5~8；批号为20131018 的样品中检出1~4；批号为20131022和20131026的样品中检出1~3。结果见表2。 3讨论 8种待测溶剂均为挥发性有机溶剂，难溶于水。经试验，待测溶剂和泽泻醇提取物在50% DMF水 溶液中溶解度均较好，故选用之。 石油醚的主要成分是低分子烷烃，其中2组分约占20%，在现有的对于石油醚的残留量检测报道中，有采用以石油醚各峰面积和为计算依据的[3.4]，也有仅采用2的响应为计算依据的[2，由于正庚烷、正戊烷为三类溶剂，中国药典中规定限量为0.5%，而2为二类溶剂，限量0.029%，因此本研究以2作为石油醚的指标性成分进行残留检测。先后采用Restek Stabilwax-DB 型和 Rtx-200 型毛细管柱分离样品中的2，均未达到理想分离效果，故改用 Rtx-5 型毛细管柱。 由于后续制剂制备工艺使用乙醇进行溶解，因此本研究不检测乙醇残留，应在制剂中加以控制。 国际ICH残留溶剂的指导原则规定2、3、4不得超过2.9×10、2×10和8.9×10，二甲苯 0.217%，对7、8未明确给出限量标准[5]。本研究的限量检查是参照中国药典二部附录ⅧP和国家食品药品监督管理局药品评审中心的一般要求进行的[6]，其限度设定为含1小于5 mg/g，含2小于290 pg/g， 含3小于2pg/g， 其他小于 20 ug/g. 表23批泽泻醇提取物中8种中留物的测定结果/x10°(x±s，n=3) Tab.3The Content of 8 Residues in Alisol Extract /x10(x±s，n=3) 批号 1 2 3 4 20131018 394.26±12.89 25.50±0.50 0.367 9±0.0162 0.279 8+0.0127 20131022 3473.20±30.44 11.60±0.35 0.266 6+0.0086 / 20131026 980.31±36.24 20.30±0.36 0.145 7±0.006 5 / 注：“/”表示未检出 ( 参考文献： ) ( [1] 束 磊，谢慧明. GC-MS法测定银杏内酯B(原料药)中石油醚残留量[J].安徽大学学报(自然科学版)，2012， 36(1)： 1 04-108 ) ( [2] 杨静，刘文英，张奕华，等.毛细管气相色谱法测定新药ZLR-8原料中9种残留溶剂量 [J].江苏药学与临床研究， 2005，13(5)：25-28 ) ( [3 金樟照，何云珍.毛细管气相色谱法测定薏苡仁油中石油 ) ( 醚残留量[J].中成药，2001，23(2)：127-128. ) ( [4] 王瑞生，闫占军，赵欣慧.气相色谱法测定天然胡萝卜素胶丸中石油醚的残留量[J].中国民族医药杂志，2005， 11(5)：40-41. ) ( [5] ICH指导委员会.药品注册的国际技术要求(质量分 部)[S].北京：人民卫生出版社，2000：87. ) ( [6] 《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》课题研究组.化学药物残留溶剂研究的技术指导原则 [S].2005：3. ) 顶空毛细管气相色谱法测定泽泻醇提取物中的溶剂及树脂残留物 作者：程志红，宋定中， 侯惠民，袁杰，、郝五四， CHENG Zhihong，SONG Dingzhong，HOU Huimin，YUANJie，HAO Wusi作者单位：中国医药工业研究总院药物制剂国家工程研究中心，上海，201203刊名：中国医药工业杂志志ISTICIIPKU英文刊名：Chinese Journal of Pharmaceuticals年，卷(期)：2014，45(9) ( 本 文链接： htt p ： / / d . g. w a n f ang d at a.c om .cn / Pe ri odi c a l _zg y y gy2 0 1 4 0 9022. asp x ) 数据