大豆油中转基因检测方案

中国农业科学22007，40(5)：1069-1072Scientia Agricultura Sinica 中 国 农 业 科学40 卷1070 一种快速、简便提取大豆油 DNA 的方法及转基因大豆油的检测 程红梅，彭于发，金芜军，贾士荣 (中国农业科学院生物技术研究所，北京100081；?中国农业科学院植物保护研究所，北京100094) 摘要： 【目的】DNA的提取是 GMO (Genetically modified organism) 作物检测中重要步骤， DNA 的质量关系到 GMO 检测的成败。 【方法】本研究以大豆油为材料，探索出一种快速、简便的提取大豆油 DNA 的方法。 【结果】该方法能从10 ml 大豆油中提取0.4ug高纯度 DNA，可用于 PCR检测。提取市场上出售的十几种精练大豆油的 DNA， 针对35S、Nos、EPSPS 和Lectin 基因进行了 PCR 检测，分别扩增出不同的目的片段。 【结论】大豆油中有残存的 DNA碎片，在转基因大豆油中能扩增出外源基因的片段。本研究为大豆油的外源基因的检测提供了可行方法。 关键词：大豆油；转基因大豆；检测方法； DNA 提取；PCR A Simple and Rapid Method for Isolation of DNA from and Detectionof Transgene Sequences in Soybean Oil CHENG Hong-mei， PENG Yu-fa’， JIN Wu-jun， JIA Shi-rong' ('Biotechnology Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081；Institute of Plant Protection，Chinese Academy ofAgricultural Sciences， Beijing 100094) Abstract： 【Objective】DNA extraction is an important step in GMC (Genetically modified crop) detection. 【Method】In thispaper we have developed a simple and rapid- method for extraction of DNA from soybean oil. 【Result】A yield of 0.4 ug NA/10 mloil can be obtained. PCR amplification of sequences of 35S， Nos， EPSPs and an endogenous reference gene lectin in 11 marketavailable brand of refined soybean oil was performed. Results showed that the sequence-specific fragments were amplified in all ofthe samples， demonstrating that the method could be applied for detection of transgene sequences in refined soybean oil.【Conclusion】There are some DNA fragments in soybean oil， and PCR amplification can detect the foreign DNA. This researchprovide a method to isolate and detect the foreign DNA in soybean oil. Key words： Soybean oil； Transgenic soybean； Detection method； DNA extraction； PCR 引言 【研究意义】20世纪80年代世界上第一例转基因植物诞生以来，到2000年，转基因作物种植面积已达4420万公顷，比1999的3990万公顷增加 11%，1996~2000的5年间增长25倍。美国种植了3030万公顷、阿根廷种植了1000万公公、加拿大300万公顷、中国50万公顷。转基因大豆种植发展最快，2003年全球有4140万顷，2004年达到5022万顷，2005年6370万顷(占全球转基因作物面积的71%)。 转基因作物及其产品已大量进入到人们的日常生活中。0【前人研究进展】由于对转基因作物及其产品安全性的关注及国际贸易等问题，世界许多国家纷纷出台了严格的管理法规，欧盟、日本、韩国、台湾等国家和地区的转基因产品的标签制度，明确要求食品中超过1%或5%含量的转基因成分必须实施标签。在中国，由于检测技术和设备落后，国外大量转基因产品在毫不知情的情况下涌入国内，尤其是国内企业在商业利益的驱动下，利用转基因原料生产食品。如2000年中国进口大豆1040万吨，其中大部分为转基因大 ( 收稿日期：20 0 5-10-20； 接 受日期：2006-11-28 ) ( 基金金目：国家“863”计划资助项目2001AA212311 和2004AA212222 ) ( 作者简介：程红梅(1967-)，女，河南信阳人，研究员，博士，研究方向为棉花抗病基因工程及转基因生物安全性研究。Tel：010-62130148； 010- 62133685； E -mail：chenghm@caas.net.cn ) 豆，对国产大豆生产造成巨大冲击。中国也于2002年5月公布了转基因农产品的标识规定，并于2003年3月20起正式实施2，3]。 【本研究的切入点】转基因大豆及其制品实施标识管理，由于大豆油成分特殊，目前国内尚缺乏检测试剂盒和相关的规范研究。【拟解决的关键问题】针对以上情况，本研究以大豆油为材料，探索出-种快速、简便的提取大豆油 DNA 的方法，并提取市场上出售的十几种精炼大豆油的 DNA，针对 35S、Nos 和Epsps 等外源基因和内源基因Lectin进行了 PCR检测，可以为检测部门提供评判标准。 材料与方法 1.1 材料 市售的大豆色拉油，品牌有：北鹰(2001-5-15)、红灯(2001-7-12)、金龙鱼(2001-6-12)、元宝 (2001-9-3)、火鸟(2001-10-9)、绿宝(2001-8-4)、四海(2001-8-27)、福临门(2001-7-11)、大满贯(2001-7-19)、贝特力(2001-7-27)。中昌转基因大豆油作为阳性对照。 1.2 试剂 自制的大豆油提取试剂盒。Taq DNA 聚合酶及其缓冲液购自华美公司， dNTPs 购自 Promega 公司。其余均为国产分析纯试剂。PBS缓冲溶液： NaCl (138mmolL)，KC1(2.7 mmolL)，NazHPO4(10 mmolL)，NaH PO4(1.8mmolL)。 1.3 PCR引物 图1显示Monsanto 公司转基因抗草甘膦大豆中转基因质粒图谱。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和扩增片段长度见表1。 1.4 PCR 反应条件 图1Monsanto 公司用于转化大豆的抗草甘膦基因的质粒图谱 Fig.1Plasmid map contained glyphosate-resistant gene introduced into soybean by Mosanto company 表1 ：35S、EPSPS 和Nos 基因的引物及产物大小 Table 1 List of different specific primer and the size of their product 基因 引物序列 产物片段大小 Gene Primer sequence Amplified fragment(bp) 35S 5'CgCAAgCTTgATATCATggTggAgCACgACACTC一3' 500 5' ATCTgCAgTCCATTgTTAgAgATAgATTTgTAgAgAg3 EPSPS 5'CCTTCATgTTCggCggTCTCg3' 493 5' gCgTCATgATCggCTCgATg 3' Nos 5' TTA AgA TTg AAT CCT gTT gCC g 3' 192 5' TAA TTT ATC CTA gTT TgC gCgC3' Lectin 5'GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3' 118 5' GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3' PCR 反应体系为 50 pul，模板 DNA 为1~100 ng，PCR 反应缓冲液终浓度为 50 mmolLKCl， 10 mmolL-Tris-C1(pH8.3)， 2~4 mmolL"MgCl， 0.2mmolLdNTP， 0.1 umolL"引物， 1~2U Taq DNA聚合酶。EPSPS 引物反应条件：95℃3 min， (94℃1min， 56℃1 min， 72℃1 min) ×35个循环，72℃10 min.35S引物反应条件：95℃3 min，(94℃1min，53℃1 min，72℃1 min) x35个循环，72℃10 min。 NOS引物反应条件：95℃3 min， (94℃1 min， 56℃1 min， 72℃1 min)x35个循环，72℃10 min。Lectin 引物反应条件：95℃2 min， (94℃30s， 62℃30s， 72℃30s)x35个循环，72℃10 min。 2 结果与分析 2.1 大豆油 DNA 的提取方法 目前国内外的 GMO 提取试剂盒都不能从油中提取 DNA， 本研究经反试试验，开发出离心柱法提取精炼大豆油 DNA 的试剂盒，已从10 ml油中提取出0.4ug DNA。人工手提法也能在500 ml 油中提取0.4 ugDNA。 2. 1.1 人工手提法 取 500 ml精炼大豆油加入500ml正己烷，在磁力搅拌器中充分混匀，4h；加入1000ml PBS 缓冲溶液在磁力搅拌器中充分混匀，6h；12000xg离心20 min， 小心取出下层水相；加入(NH)4SO4沉淀过夜。12 000xg 离心20 min， 保留沉淀；在沉淀中加入800 pl HzO， 充分溶解沉淀后，加入等体积的酚和氯仿抽提，12000xg离心10 min， 取上清，加入二倍体积的无水乙醇，4℃20 min， 12 000xg离心10min，保留沉淀，自然风干后，加入 50 ul 水溶解沉淀，电泳定量(图2)。 2. 1.2 离心柱法 取10ml 精炼大豆油加入10 ml 正己烷，在磁力搅拌器中充分混匀，2h；加入20 mlPBS在磁力搅拌器中充分混匀，2~3h； 12000xg离心20min，小心取出下层水相；加入等体积的异丙醇，混匀，常温置10min 后， 12000×g离心10 min， 去上清，保留沉淀；加入1 ml HO溶解沉淀，加入1ml异丙醇，混匀，常温置 10 min 后，12000×g离心 10 min，去上清，保留沉淀；在沉淀中加入60pl HzO，充分溶解沉淀，5 min 离过离心柱，分别加入配套试剂，最 A：ADNA/HindIII+EcoRI；B：人工手工法， 10 ul； C：离心柱法，10plA： ADNA/HindIII+EcoRI； B： manul method， 10 pl； C minicolumn method，10ul 图22大豆油 DNA 的提取的电泳图 Fig.2Agarose gel of soybean oil DNA extraction product 后离心获得的溶液即可作为 PCR 反应的模板，建议一个PCR反应使用1 ul DNA，其余样品保存在-20℃(图2). 从目前市售的大豆色拉油分别提取 DNA，定量后进行PCR扩增(表2)。 Table 2 PCR results of different soybean oil brands by using different primers 贝特力北鹰 元宝 绿宝 福临门 大满贯 火鸟 红灯 四海 金龙鱼 转基因大豆 非转基因大豆 Beiteli Beiying Yuanbao Lubao Fulingmeng Damanguan Huoniao Hongdeng Sihai Jinlongyu Transgenic Non-transgenic soybean soybean 35S - + + + + + 十 + + - Partly-EPSPS + + + + - + + + - Nos + + + 一 + + - Lectin + + + + + + 结果表明，在10个品牌中，除用内源基因扩增均呈阳性外，在其余3个引物扩增均呈阳性的有5个品牌，分别为：元宝、四海、金龙鱼、福临门、大满贯；2个引物扩增是阳性的有4个品牌，分别是：火鸟、北鹰、贝特力；1个引物扩增是阳性的有1个：红灯、绿宝。目前市售的大豆色拉油多为转基因大豆榨制而成。而大豆油中含有转基因成分的含量有待进一步研究。 3 讨论 随着 GMO 标识制度的实施，提取 GMO 的 DNA结合定量和定性 PCR 的方法作为的主要检测手段被广泛应用。国内外在转基因产品检测方面的研究发展迅速，主要针对抗草甘膦大豆4.5]，抗草甘膦油菜的 报道，研究多集中在转基因作物种子和叶片。由于在PCR检测中，样品 DNA 的数量和纯度是检测成功的关键7。直接从植物组织中提取 DNA 比较容易，深加工转基因食品(例如：油、蜂蜜、牛奶、酱油、土豆片等)，在加工过程中由于物理、化学或发酵的操作使得 DNA 的提取变得非常困难，从而制约着这类产品的检测。大豆油中99.9%是脂类， DNA 含量很少，提取也非常困难。本研究以大豆油为材料，选用即可以和油相溶又可以和PBS缓冲液有一定的溶解度的正己烷处理样品，使残存在油中的 DNA 交换到缓冲液中，然后对该缓冲液纯化处理，得到高品质的DNA。该方法可以适用于油菜油和油脂含量较高的产品。目前国内外尚未有成功从油脂类产品中提取 DNA的报道，后续研究可从以下几个方面进行：((1) 以本 A：Lection geneB： 35S promoter C： EPSPS geneD：NOS terminatorl 图3 转基因大豆油中 Lection 基因、35S 启动子、EPSPS基因和NOS终止子的 PCR 检测结果 Fig. 3 Agarose gel of PCR products showing the Lectiongene，35S promoter， EPSPS gene and NOS terminatorl 文研究结果为基础，将从大豆油中 PCR 扩增产物进行DNA序列测定，以证明确实是来自外源 DNA. (2)将提取的大豆油总 DNA 做 Southern 杂交和荧光定量PCR以获得可能的基因拷贝数量。3进一步优化条件，开发研制试剂盒。 4 结论 4.1 本文首次报道了一种快速、简便的提取大豆油DNA的方法，该方法能从 10 ml 大豆油豆提取 0.4 ug高纯度 DNA，可用于 PCR检测。 4.2 提取市场上出售的十几种精练大豆油的 DNA，针对35 S、Nos、EPSPS 和 Lectin 基因进行了 PCR检测，分别扩增出不同的目的片段。 ( References ) ( [ 1 ] Clive J. Preview： Global Status of Commercialized Transgenic Crops：20035.ISAAA.o.304-20035. ) ( [2] 金芜军，贾士荣，彭于发.不同国家和地区转基因产品标识管理政策比较.农业生物技术学报，2004，12(1)：1-7. Jin W J， Jia S R， Peng Y F . Comparison of labeling policy of geneticallymodified p r oducts in di f ferent c o untries and te r ritories， Journal ofAgricultural Biotechnology， 2004， 1 2 (1)：1-7.(in Chinese) ) ( [3] 贾士荣，金芜军.国际转基因作物的安全性争论.农业生物技术学 报 ，2003，11(1)： 1 -5. Jia S R ， J i n W J. In t ernational de b ate on b io s afety of geneticallymodified crop：scientific review o n several c ases of debate. Journal ofAgricultural Biotechnology，2003，1 1( 1 ) ：1 - 5.(in Chinese) ) ( [4] Meyer R . 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