肉制品中沙门氏菌检测方案

责任编辑朱永和责任校对朱永和安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2006， 34(2)：222，226 2006年安徽农业科学226 PCR 技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究 尹荣焕1，尹荣兰1，杨玉英2，潘树德1，苏振山l，白文林1 (1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110161；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319) 摘要 进行了 PCR 技术检测熟肉制品中的沙门氏菌的试验。电泳扩增产物表明：人工污染沙门氏菌的熟肉制品检测呈阳性，而无菌去离子水对照呈阴性。该检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，可快速、准确地检测熟肉制品中沙门氏菌，从而提高食品安全评估的效率。 关键词 沙门氏菌；PCR技术；检测 中图分类号 Q936 文献标识码A 文章编号0517-6611(2006)02-0222-01 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科中最重要的病原菌属，是细菌性食物中毒中发病率最高的一种。有资料显示，我国细菌性食物中毒中 70%~80%是由沙门氏菌引起的。据《波杰氏细菌分类学手册》第一卷(1984)，沙门氏菌属分为5个亚属，共有2020个血清型，我国发现的血清型近200个。许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素，以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最常见。该类菌对动物性食品的污染已日益引起动物饲养者、屠宰加工企业、食品加工部门、卫生检疫和监督部门，甚至广大消费者的重视。 熟肉制品包括灌肠类、酱卤类等，均属于肉类加工后可以直接入口的成品，它的卫生质量直接关系到食用者的健康。目前在熟肉制品的沙门氏菌检验中多采用传统的检测方法，一般需要 5~7 d，周期长，过程繁琐，有时还出现假阴性，这些都难以适应市场检验中快速、简便、准确率高的要求。自从美国科学家 Kary Mullis 首创了体外酶促扩增 DNA技术以来②，国内外一些学者对应用 PCR 技术检测沙门氏菌作了大量的研究，在鱼粉、骨粉等动物性饲料及畜产品的沙门氏菌检测方面均已表现出快速简便、灵敏度高、特异性强等优势。关于应用 PCR 技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究，至今少见报道，笔者对此进行了实验。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 沙门氏菌菌株。购自辽宁省兽药监察所，菌株号50094，接种到 10 ml营养肉汤中制成标准菌液，37℃增菌培养10h。 1.1.2检测样品。从市场上购得猪肉肉、酱牛肉各一份，人工感染沙门氏菌后，无菌各取检样25g，粉碎后置于MM 培养液中进行增菌培养，37℃震荡培养 10h，以供提取细菌DNA。 1.1.3 主要仪器。GeneAmp PCR System 9700 扩增仪，DYY-Ⅲ-B型稳压电泳仪，Gel Doc 2000 凝胶成像系统(GDS)，Dorf 台式高速离心机，Ultrospec 3000 紫外可见分光光度计。 1.2 基因组 DNA的提取(①取 1.5 ml细菌MM培养液放入1.5 ml离心管中，离心30s弃上清液后，加入560 p.l TE缓冲液，混合均匀后再加入35 ul10 % SDS 和5 ul浓度20mg/ml 蛋白酶K混匀，56℃水浴1 h。②加入100pl浓度5 ( 作者简介 尹荣焕(1976-)，女，河北安国人，博士研究生，讲师，从事动物性食品安全及中药免疫方面的研究。 ) mol/LNaCl，充分混匀，加入80 pl CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃水浴 10 min.③加入等体积的氯仿/异戊醇混匀，离心5 min，取上清液转入另一个离心管中，加加等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心5 min，同前取上清液移人另一离心管。④加入等体积的异丙醇，在室温下静置2 min，离心5 min，弃上清液后，加入1ml浓度70%冷乙醇，将沉淀悬浮洗涤 30s，离心5 min，弃上清液。⑤待沉淀完全干燥后，加入25 ul灭菌蒸馏水溶解沉淀，4℃放置 30 min 以上，使 DNA 充分溶解，-20℃保存备用。 1.3 PCR 引物信息 目前，国内外设计了很多能够特异性地检测沙门氏菌基因的引物，如 spvR“、fimAhilA 等，该研究选用 Rahn"设计的引物来扩增沙门氏菌 invA 基因，长度为284 bp. 序列为：引物Ⅰ：5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；引物Ⅱ：5’TCATCGCACCGTCAAAGGAACC3'.2种引物由上海博亚生物公司合成。 1.4 PCR 反应体系 PCR反映体系：无菌去离子水 19 pl，25 mM MgCl2 1.5 pl，10xBuffer 2.5 p1，20 mM dNTP0.6 pl，10nM引物各 0.6 p1，5 U/ ulTaq DNA 聚合酶 0.2 pl，DNA 模板溶液5 ul(阴性对照用无菌去离子水5 p.l 代替 DNA 模板溶液)，混匀后，每管覆盖一滴石蜡油，防止液体挥发。放入PCR仪，94℃预变性3 min，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸 5 min。 1.5 PCR扩增产物的检测 取 5 ul PCR 扩增产物，用浓度2%的琼京糖凝胶进行检测，用 Marker 作参照，在电压 100V条件下电泳 40 min， 利用凝胶成像系统观察电泳结果，284 bp处出现特异性扩增条带者为阳性，否则为阴性。 1.6 PCR扩增检测敏感性试验 用紫外分光光度计检测提取的样品基因组 DNA，进行10倍梯度稀释，将不同稀释度的样品分别作 PCR 扩增，以检测其敏感性。 2结果与分析2 引物特异性试验 引物特异性检验结果见图1。沙门氏菌阳性菌株在284 bp 扩增出一条特异亮带，阴性对照未见任何扩增产物。试验结果表明，此引物可以作为检验沙门氏菌的特异性引物。 2.2 PCR 扩增检测熟肉制品中沙门氏菌的敏感性 经测定，2份样品 DNA 含量较低者约为 200mg/L， 将此 DNA溶液分别作10-、102、103、10~等倍稀释，结果10/ul稀释度的沙门氏菌 DNA 仍可见扩增带，说明该 PCR 扩增体系 ( (1)：68-71. ) ( 11 于振文.冬小麦高产高效灌水方案的研究[J].山东农业科学，1994， (2)：3-6. ) ( 12 石岩，林琪，位东斌，等.不同灌水处理冬小麦耗水规律与节水灌溉 方案确立J]，干旱地区农业研究，1996，14(4)：7-11. ) ( 13 林琪，石岩，位东斌.土壤水与冬小麦产量形成的关系及节水灌溉 方案[J].华北农学报，1998，13(3)：1-4. ) ( 14 王家仁，王丙禄，周荣波，等.冬小麦节水高产栽培技术研究[J].灌 溉排水，2001，20(4)：43-46. ) ( 15 居辉，兰霞，李建民，等.不同灌溉制度下冬小麦产量效应与耗水特征研究[.中国农业大学学报，2000，5(5)：23-29. ) ( 16 裴冬，张喜英，陈素英，等.局部灌水方式对冬小麦产量与水分利用的影响[.干旱地区农业研究，2004，22(4)：60-64. ) ( 17 杨具瑞，方铎，成自勇，等.不同节水灌溉技术的节水机理试验研究 [中国农村水利水电，2003，(6)：66-68. ) -+*+++十 + -+++ *++++w- +---+---+-*-+-+一 (上接第222页) 能检测出 20pg 的沙门氏菌 DNA，敏感性极强。 2.3 PCR 扩增检测熟肉制品中沙门氏菌 由图1可见，沙门氏菌标准菌株和2种人工污染的熟肉样品提取是 DNA扩增电电，均在284 bp 扩增出一条特异亮带，同阴性对照区别明显。故通过 PCR 扩增能够准确确定这2份熟肉制品污染了沙门氏菌，与实际情况相符。 注：M为 Marker；1、2为人工污染的猪肉肠样品；3、4为人工污染的酱牛肉样品；5为阴性对照；6、7为沙门氏菌阳性菌株。 图1 PCR扩增产物电泳 3 讨论和结论 熟肉制品中有包装产品多数是由规模的厂家生产的，检验、监督程序都比较完善，产品合格率较高。而市场上无包装的酱卤类肉制品有很多来源于个体摊贩，有些人的卫生质量意识差，一味地追求经济利益，在生产、加加、贮藏、销售的各个环节稍不注意，就很容易导致微生物的污染。根据 GB/T 4789.4-2003，检测食品中沙门氏菌必须有一个增菌过程。为了减少检测时间，R Ferretti采用在缓冲蛋白胨水(BP)中非选择性增菌6h，然后进行细胞破碎和 PCR 检测，可在12h内完成检测。但这样不可避免地会受到诸多杂菌的干扰。该试验中采用选择性氯化镁孔雀绿(MM)增菌液培养10h，可以抑制其他大多数细菌的生长，PCR检测电泳结果表明，无非特异条带，扩增产物纯净。因此，将 PCR技术用于加工后食品卫生安全检测，具有快速、准确的优 ( 18 康绍忠，张建华，梁宗锁，等.控制性交替灌水——一种新的农田 节水调控思路[.干刀地区农业研究，1997，15(1)：1-6. ) ( 19 康绍忠，蔡焕杰，主编.作物根系分区交替灌溉和调亏灌溉的理论 与实践[M].北京：中国农业出版社，2002.82-90. ) ( 20 王恒俊，张岁岐.地膜小麦增产节水水果与适播期研究初报[J].水 土保持研究，1999，6(1)：68-71. ) ( 21 张修森.地膜覆盖对冬小麦几个主要农艺性状的影响[J].麦类作 物学报，1998，18(5)：58-60. ) ( 22 黄明镜，晋凡生，池宝亮，等.地膜覆盖条件下旱地冬小麦的耗水特 征.干旱地区农业研究，1999，17(2)：20-23. ) ( 23 张忠学，温金祥，吴文良.华北平原冬小麦不同培肥措施的节水增 产效应研究[.灌溉排水，2000，19(1)：9-11. ) ( 24 索学芳，温小霞.不同肥力条件下抗旱剂对旱坡地小麦的增产效应 [J].麦类作物，1999，19(4)：63-64. ) 点，必将提高食品安全评估的效率。 用 PCR 技术检测熟肉制品中的沙门氏菌，能够选择的引物很多，该试验扩增产物是沙门氏菌的 inv A 基因。资料显示，沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein，inv)决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门氏菌的致病性密切相关，编码 inv 蛋白的基因包括 invA、invB、invC、invD 和 invE等一组基因，它们在沙门氏菌中广泛分布，而invA 基因编码的蛋白在细菌的致病过程中起着重要作用，属于沙门氏菌的主要毒力因子子。 试验结果表明，以 PCR 扩增 inv A 基因检测熟肉制品中的沙门氏菌具有高度的特异性和敏感性。 ( 参考文献 ) ( 曾晓芳.畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制[J].四川畜牧兽医， 2003，30(4)：28-29. ) ( 2 M ullis K B ，Faloona F A . 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