牛肉、猪肉中头孢噻呋检测方案

维普资讯 http：//www.cqvip.comVol.27 No. 2178~180 维普资讯 http：//www.cqvip.com纳诺仪器nano instrument姜 维等：液相色谱法对牛、猪肌肉和肾脏中头孢噻呋残留量的测定研究第2期 免费服务热线：4009-217-117爱仪器 要仅器 网址：http：//www.nano-instru.com http：//nanoinstru.instrument.com.cn 液相色谱法对牛、猪肌肉和肾脏中头孢噻呋残留量的测定研究 姜 维，方晓明2，唐毅锋²，庞国芳3，陶宁萍 (1.上海水产大学 食品学院，上海200090；2.上海出入境检验检疫局，上海200135：3.秦皇岛出入境检验检疫局，河北 秦皇岛 066002) 摘 要：采用高效液相色谱法测定牛、猪肌肉和肾脏中头孢噻呋相关残留量。样品经二硫赤藓糖醇溶液提取，碘乙酰胺衍生，固相萃取柱(C8、SAX 和SCX)净化， Cig柱色谱分离，以乙腈-水(体积比15：85)含0.1%三氟乙酸作流动相等梯度洗脱，266 nm 紫外检测。头孢噻呋残留量在0.016~1.28 mg/L范围内与峰面积呈良好线性，相关系数r>0.999 9。样品添加浓度在200~8 000 pg/kg的回收率为90%~91%，相对标准偏差为1.8%~3.5%。本方法的检出限(信噪比 S/N=3)为50 ug/kg。 关键词：高效液相色谱；头孢噻呋；动物组织；脱呋喃甲酸头孢噻呋；呋喃甲酸 中图分类号：0657.72； R978.1 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2008)02-0178-04 Determination of Ceftiofur Related Residues in Bovine and PorcineMuscle and Kidney by High Performance Liquid Chromatography JIANG Wei， FANG Xiao-ming’， TANG Yi-feng， PANG Guo-fang'， TAO Ning-ping' (1. College of Food Science and Technology， Shanghai Fisheries University， Shanghai2200090， China； 2. Shanghai Exit -Entry Inspection and Quarantine Bureau， Shanghaiai2200135， China； 3. QinhuangdaoExit-Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qinhuangdao066002， China) Abstract： Ceftiofur related residues in bovine and porcine muscle and kidney were determined byhigh performance liquid chromatography. Samples were extracted with dithioerythritol， derivatizedwith iodoacetamide and cleaned up on C8， SAX and SCX solid-phase extraction cartridges. Chroma-tographic separation was carried out on a Ci8 column (250 mm×4.6 mm， 5 um) with acetonitrile -water (15： 85 by volume) containing 0.1% trifluoroacetic acid as mobile phase at a flow rate of1 mL/min， followed by determination of the residue by ultraviolet absorption detector at 266 nm. Cal-ibration curve was linear between 0. 016 and 1.28 mg/L， with the correlation coefficient r>0.999 9.The recovery and relative standard deviation ranged from 90% to 91% and 1.8% to 3. 5% at spikedlevel of 200-8000 ug/kg， respectively. The detection limit of the proposed method was 50 ug/kg. Key words： HPLC； ceftiofur； animal tissue； desfuroy leceftiofur； furoic acid 头孢噻呋( ceftiofur)是第一个动物专用的头孢菌素类抗生素，主要用于生畜呼吸道疾病的治疗。如果兽药不合理使用，会导致动物性食品药物残留超标，长期食用可引起细菌耐药性，造成人体微生物环境紊乱和失调。头孢噻呋在体内迅速代谢为脱呋喃甲酸头孢噻呋( desfuroyleceftiofur， DFC)和呋喃甲酸(furoic acid)，其中 DFC 为标志性残留物。目前，欧盟和加拿大等一些发达国家规定头孢噻呋及其代谢物在动物组织中的最大残留限量(MRL)：肌肉1000 ug/kg、肾6 000 ug/kg. 头孢噻呋残留量的检测方法有微生物检测法21、免疫分析法[3-4]和液相色谱法15-71。微生物法样品处理简单、回收率较高，但不易筛选到特别敏感的菌株，缺乏特异性，而且多数分析周期较长。免疫分析法灵敏度高，特异性比微生物法强，适合于大量样品的快速筛选。液相色谱法(HPLC)是已报道用于头孢噻呋残留检测最常用的检测方法5。液相色谱-质谱法(LC-MS)可用于残留确证分析[6-7]，但所用仪器要求高、价格昂贵。本文采用 HPLC/UV 法测定牛、猪肌肉和肾脏中的头孢噻呋相关残留 ( 收稿日期：2007-01-24；修回日期：2007-04-11 ) ( 第一作者：姜 维(1982-)，男，安徽马鞍山人，硕士研究生 ) ( 通讯作者：方晓明， Tel：021-6854999 9 -15126， E -mail： fangxm@ shciq. gov. cn ) 量。与 Jacobson 等5不同，采用多个固相萃取柱净化样品，虽然增加了操作步骤，但大大消除了样品基体对被测物的影响，检出限更低，且方法的回收率和精密度均较好。 实验部分 1.1 仪器与试剂 Waters 高效液相色谱系统，510泵体，2487紫外-可见光检测器，717自动进样器，配Empowerpro 色谱软件。固相萃取装置( Supelco 公司)。C固相萃取柱(500 mg，Varian公司)，使用前用4mL甲醇和5 mL 0.025 mol/L 磷酸缓冲液淋洗活化。SAX 固相萃取柱(500 mg， Varian 公司)，使用前依次用2mL甲醇、2mL甲醇-0.1 mol/L氯化钠(体积比25：75)和2mL 水淋洗活化。SCX 固相萃取柱(100 mg， Varian 公司)，使用前依次用1 mL甲醇、2 mL甲醇-0.1 moL/L氯化钙(体积比25：75)和4 mL水淋洗活化。 头孢噻呋标准品(纯度96.0%， Dr. Ehrenstorfer公司)；；二硫赤藓糖醇(纯度99%， Sigma公司)；碘乙酰胺(纯度97%， Sigma 公司)；三氟乙酸(纯度97%)；乙腈、甲醇(色谱纯)；其他试剂为分析纯，水由 Milli Q净化系统(Millipore公司)制得。 1.2 溶液配制 头孢噻呋储备液(100 mg/L)：称取10.0 mg 头孢噻准标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20℃保存，可使用6个月。头孢噻呋中间液(5 mg/L)：吸取250 p.L 100 mg/L 头孢噻呋储备液至5mL容量瓶中，用0.025 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)定容，摇匀(现配现用)。0.025 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)：将3.4g磷酸二氢钾溶于900 mL 水中，用450 g/L 氢氧化钾溶液调节 pH值至7.0，用水定容至1L。0.05 mol/L硼酸缓冲液：称取19g硼酸钠和3.7g氯化钾，用水定容到1L；4g/L二硫赤藓糖醇溶液：称取1.0g二硫赤藓糖醇，溶于250 mL 0. 05 mol/L 硼酸缓冲液中(现配现用)； 40 g/L碘乙乙胺溶液：称取2.0g碘乙酰胺，溶于50 mL 0. 025 mol/L 磷酸缓冲液中(现配现用)。 1.3 色谱条件 Ci柱(250 mm×4.6 mm， 5 pm)；流动相：乙腈-水-三氟乙酸(体积比15：85：0.1)；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：266 nm；进样量：25pL。 1.4 样品处理 1.4.1 提取与衍生 称取1.0g组织样品于50mL离心管中，加入14 mL 4 g/L 二硫赤藓糖醇溶液，均质，然后放入恒温振荡水槽仪中37℃保温20 min。加入3 mL 4%碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30 min，离心10 min(4℃， 20 000 r/min)，取出上清液于25 mL比色管中。残渣中加入6mL0.025 mol/L 磷酸缓冲液，混匀，离心10 min(4℃， 20000 r/min)， 合并上清液，用25%磷酸溶液调节pH值至2.5~2.6，用水定容至25 mL。取出 10.0 mL定容液，离心15 min(4℃， 20 000 r/min)。1.4.2 净 化将“1.4.1”最后所得的上清液过C g固相萃取柱，保持流速1~2mL/min， 再依次用5 mL 磷酸缓冲液和3 mL 0.01 moL/L 氢氧化钠溶液淋洗，用2mL乙腈-水(体积比15：85)洗脱并收集于含5 mL水的试管中，保持抽真空2 min。取出收集的试管，加入5mL水，摇匀，过 SAX 固相萃取柱，保持流速1~2mL/min， 用1mL水润洗试管，加入柱中，用2.5 mL乙腈-体积分数为5%乙酸(体积比5：95)洗脱并收集于另一含5 mL水的试管中，保持抽真空2 min。取出收集的试管，加入5mL 水，摇匀，过 SCX 固相萃取柱，保持流速1~2mL/min，用1mL水润洗试管，加入柱中，用2.5mL乙腈-0.1 mol/L氯化钠(体积比5：95)洗脱并收集，保持抽真空2 min。取出收集的试管，摇匀，供测定。 1.4.3 标准品处理 移取适量头孢噻呋中间液至 50 mL离心管，加入14 mL 4 g/L 二硫赤藓糖醇溶液，然后放入恒温振荡水槽仪中37℃保温20 min。加入3 mL 40 g/L碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30 min， 加入 6 mL 0.025 mol/L 磷酸缓冲液，用25%(体积分数)磷酸调节pH 值至2.5~2.6，用水定容样液至25 mL。其余操作步骤同“1.4.2”节。 2 结果与讨论 2. 1 衍生化 头孢噻呋在动物体内主要以脱呋喃甲酸头孢噻呋(DFC)代谢物存在， DFC 可与体内生物大分子(如血浆蛋白)结合。结合态的 DFC 不容易被水性溶液提取，因此要将结合态变成游离态。二硫赤藓糖醇可以把蛋白结合的 DFC 及母体药转化为 DFC， 游离的 DFC 与碘乙酰胺反应，生成具有紫外吸收的衍生物脱呋喃甲酸头孢噻呋乙酰胺( DCA)。 2.22净化条件的选择 提取、衍生后的样液净化采用C用g柱、SAX 阴离子交换柱和 SCX 阳离子交换柱3种不同的固相萃取柱。Cis柱主要去除中性杂质， SAX 柱主要去除阳离子化合物， SCX 柱主要去除阴离子化合物。本实验考察了1根柱(C8柱)、2根柱(C8柱和SAX 柱)和3根柱(Cg柱、SAX 柱和 SCX 柱)的净化效果，发现单独使用C8柱和使用 C8与 SAX 柱的净化效果均不理想，样液中其它组分对测定有干扰。同时使用 3根固相萃取柱，净化和富集效果较好(见图1)。 固相萃取柱的上样量对柱子的提取和净化有影响。实验发现，如果样液(25mL)全部过柱，高浓度添加样品的回收率偏低，表明柱容量过载，有部分待测物流失。分取部分样液(10mL)过柱，回收率明显提高，即使在高浓度时，也能满足定量检测的要求。 2.3 流动相的选择 流动相采用乙腈-水(该体系均含 0.1% TFA)或甲醇-水(含0.1%TFA)体系，发现乙腈-水体系优于甲醇-水体系。以乙腈-水(体积比10：90)和乙腈-水(体积比90：10)进行梯度洗兑，或以乙腈-水(体积比15：85)等度洗脱，头孢噻呋衍生物 图1 标准样品添加猪肾样品经固相萃取柱净化后的色谱图 Fig. 1Chromatograms of spiked standard sampleporcine kidney sample cleaned up on SPE cartridgesporcine kidney sample( fortified with 200 g/kg)cleaned up on C1g， SAX and SCX cartridges (DCA)的分离效果都比较好，样液中的其他组分对测定无干扰。由于梯度洗脱进样前需要平衡，分析时间较长，故选择等度洗脱。流动相中乙腈比例增加，头孢噻呋衍生物(DCA)出峰提前，但分离度变差。 2.4 头孢噻呋衍生物的稳定性 对 1.28 mg/L头孢噻呋标准品衍生物(DCA)作稳定性试验，发现衍生物在4℃、避光条件下保存1个月，峰面积与刚衍生完时的峰面积几乎一致。 2.5 线性范围与检出限 在质量浓度0.016~1.28 mg/L(相当于添加量为100~8000 ug/kg)范围内，峰面积(y)与质量浓度(x)呈良好的线性关系，其线性方程为y=5.0167x+139.3，相关系数(r)大于0.9999。根据3倍信噪比确定检出限为50 ug/kg。 2.6 回收率与精密度 本实验以4种动物性产品(牛肾、牛肉、猪肾、猪肉)作为样本。取适量标准品加入到1.0 g样品中，使添加量在牛肾和猪肾中相当于200、6000和8000 g/kg， 在牛肉和猪肉中相当于200、1000和2000 pg/kg，每个添加水平各取24份试样，按“1.4.1~1.4.2”节所述步骤进行处理，加标平均回收率为90%~91%，相对标准偏差(RSD)1.8%~3.5%，结果满意。 本方法经8家实验室的协同试验，肾脏样品添加量在200、6000和8000 ug/kg 和肌肉样品添加量在200、1000和2000 ug/kg时(每个添加量单独测定2次)，测得实验室间平均回收率为88%~91%，相对标准偏差为4.2%~6.1%。 2.7 应 用 取阳性样品牛肾和牛肉按“1.4”步骤进行处理和测定，由结果知，样品中其他组分对测定无干扰， ( (下转第184页) ) -w- 一 据处理功能(间隔为0.5 nm)和 Origin 7.5求积分功能，得到J=5.2×10-15cm’·L ·mol-；再由(2)式求出R，值。一般认为药物对 BSA 的荧光猝灭作用主要源于212位色氨酸残基。当c(E)：c(BSA) =1：1(相对分子质量以2000计)时， E=1-Ip/1=0.13由(1)式求出r值，得r=2.15 nm。 ( 参考文献： ) ( [1] 王彦卿，张红梅，张根成.荧光光谱法研究黄藤素与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析 测 试学报，2006，25 (5)：48-51. ) 2关洪亮，原华平，潘祖亭.氯氮平与蛋白质相互作用的研究[J].分析测试学报，2006，25(3)：25-28.34 ( 朱铿，童沈阳.荧光黄与蛋白质相互作用的研究[J].高等学校化学学报，1996，17(4)：539-542. ) ( 张晓威，赵凤林，李克安.环丙沙星与牛血清白蛋白相互作用的研究[J].高等学校化学学报，1999，20(7)： 1063-1067. ) ( 王敬政，贺吉香，江崇球.芦荟大黄素与血清白蛋白的相互作用[J].分析化学，2001，29(7)：782-78. ) ( 颜承农，上官云凤，潘祖亭，等. 日 甲苯咪唑与牛血清白蛋白作用的荧光光谱特征[J].分 析 测试学报，2003，22 (4)：24-27. ) ( 7] 易平贵，商志才，俞庆森，等.丝裂霉素C与牛血清白蛋白结合作用的研究[J].化学学报，2000，58(12)： 1649-1653. ) ( 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