连续灌流培养产凝血酶原CHO工程细胞

Vol.17 No.lJanuary22001生 物 工 程 学 报Chinese Journal of Biotechnology17卷1期2001年1月 生 物 学 报17 卷110 E-mailshwu@chinajournal. net.cn万方数据 用改装的 Super-Spinner 搅拌瓶连续灌流培养产凝血酶原 CHO工程细胞 陈昭烈1*Kai Iding Dirk LiitkemeyerJurgen Lehmann (军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071) 2(德国比勒菲尔德大学细胞培养技术研究所，比勒菲尔德) 关键词 连续灌流培养， CHO工程细胞，凝血酶原 中图分类号 Q813.11 文献标识码 A 文章编号1000-3061(2001)01-0109-04 在动物细胞培养过程中对培养体系实施培基连续灌流能及时地补充细胞生长所需的营养物质、控制细胞代谢产物对细胞的影响，实现细胞的高密度长期培养，提高片的产品的生产效率11.2.。细胞连续灌流培养的前提是在实施培基连续灌流的同时培养体系能有效地截留细胞。这一前提增加了细胞培养装置的复杂程度，使之特化为价格昂贵的生物反应器，限制了细胞连续灌流培养的应用。如能通过对普通的细胞搅拌培养瓶进行改进，使之能用于细胞的连续灌流培养，则有利于细胞连续灌流培养的推广应用。 材料和方法 1.1 细胞 产人重组凝血酶原 CHO 工程细胞 CHO2DS 是由含凝血酶原目的基因和dhfr 标记基因及 G418抗性基因的表达载体，用电击法转染 CHO-dhfr 细胞所建立的具有稳定表达凝血酶原表型的细胞株(由 BASF AG Germany 提供)。在含维生素K；培基中，CHO2DS 所产生的凝血酶原以羧化的活性单体存在于细胞培养上清中。 1.2 培基和载体 DMEM、F12和新生牛血清为 GIBCO产品。尤蛋白培基DF6S以优化的 DMEM：F12(1：1)为基础培基，添加丙酮酸钠、金精三羧酸(Auritricaboxylic acid，ATA)，醇胺、柠檬酸铁、维生素C、腐胺 (Putrescine) 和 Pluronic F68 配制而成14]。丙酮酸钠和乙醇胺为 MERCK产品，其之培基添加成分均购自 Sigma 公司。细胞固定化培养载体 Cytopore 1 多孔微球购求 Pharmaciac 1.3 Super-Spinner 细胞搅拌培养瓶的改装 在LL Super-Spinner 搅拌瓶的转动轴上定定一直径2.6cm、高4.5cm，孔径为 75pm 的不锈钢滤筒，不锈钢滤筒的固定位置以瓶内注注1L液体时，其上部高出液面1.5cm 为准。自 Super-Spinner 搅拌瓶的瓶盖引人内径为2mm硅橡胶管作为培基灌流管路，进液管高出液面，出液管插人不锈钢滤筒内，培基的灌流用蠕动泵驱动(图1)。在 Super-Spin-ner 搅拌瓶的侧口通细细胞采样管和平衡液面气体分压的通人管。在瓶盖设两个通气口，供气硅橡胶管与其相接并缠绕于固定在转动轴下部的支架上。缠绕于支架上的供气硅橡胶管，在磁力搅拌器的驱动下随支架转动而起到搅拌叶片的作用、细胞培养时将 Super-Spinner 搅拌瓶置于37℃、5%CO，的培养箱内，供气管路的进气管连接放置于培养箱内的气泵，供气管路的气体压力由出气管路上的调节阀控制。 图1 用 Super-Spinner 搅装瓶改装的细胞连续灌流培养系统示意图 Fig. 1 A sketch map showing the continuous perfusionsystem based on a 1L modified Super-Spinrier 1.4 细胞培养 CHO2DS细胞在组织培养瓶中用含5%新生牛血清的DMEM： F12(1：1)贴壁培养，待细胞形成致密单层后，用0.25%的胰蛋白酶进行消化，经不含 NBS的 DMEM：F12 洗涤后，用 DF6S 悬浮 CHO2DS 细胞。 将 CHO2DS细胞接种于 ( 收稿期：2000-06-28，修回日期：2000-10-19. ) ( *通讯作者。Tel：86-10-63841526； Fax：86 - 10-63833521； E-mail ： chenzlCnie. bmi. ac. en 方方数据 ) 经改装的1L Super-Spinner 搅拌瓶，37℃、5% CO培养条件下实施批次悬浮培养，搅拌速度设度为30 r/min；在经改装的 1L Super-Spinner搅拌瓶内用 Cytopore 12g/L 固定CHO2LS细胞，白培养的第3天起实施配基连续灌流，灌流量由250mL/d逐渐加大至1500mL/d。取样测定细胞密度、凝血酶原浓度、葡萄糖浓度和乳酸浓度， 1.5 细胞计数和凝血酶原浓度测定 组织培养瓶中贴壁培养和 Super-Spinner 搅拌瓶批次悬浮培养的 CHO2DS细胞密度用血球计数板直接计数；用改良 MTT比色法51计数 Cytopore 1 固定化培养的 CHO2DS活细胞密度，所用试剂四甲基偶氮唑蓝(MTT)为 Fluka 产品，N.N二二基酰胺、Triton X-100 为 Sigma 试剂。采用ELISA 测定培胞培养上清的凝血酶原浓度6，人凝血酶原标准品为 Calibiochem-Novabiochen公司产品，羊抗人凝血酶原抗体购自 Cedarlane Laboratories 公司。 1.6 细胞粒径和细胞截留率测定 用细胞让数和分析系统(CASY 1， Scharfe SystemGmbH，Reuttingen， Germany)测定细胞粒径，细胞粒径≤25um 的 CHO2DS按单个悬浮细胞计数，细胞粒径>25um的CHO2DS 计为悬浮的细胞团，单个细胞在培养体系中所占的百分比按下式确定： 细胞粒径≤25pm 的 CIO2DS/(细胞粒径≤25pm的CHO2DS+细胞粒径)25jm的 CHO2DS)×100； 细胞截留率按下式确定： (不锈钢滤筒外的细胞密度 不锈钢滤简内的细胞密度)/不锈钢滤筒外的细胞密度×100。 1.7 葡萄糖和乳酸的测定 采用 YSI-2700乳酸、葡萄糖自动测定仪(Yellow SpringInstruments，USA)检测细胞培养上清中的葡萄糖和乳酸浓度。 2 结 果 2.1 用改装的Super-Spinner 搅拌瓶批次悬浮培养 CHO2DS 在改装的1L Super-Spinner 搅拌瓶中用 DF6S悬浮培养CHO2DS细胞，细胞接种密度为2.3×10cells/mL，搅拌速度设置为 30 r/mine 在培养的起始阶段 CHO2DS细胞球形均匀悬浮于培基中，其中细胞粒径≤25pm的 CHO2DS 占细胞总数的93.1%。由于不锈钢滤筒的孔径远大于细胞粒径，CHO2DS细胞易于穿过不锈钢滤筒的微孔进入不锈钢滤简内，不锈钢滤筒的细胞截留率只有4.7%，无法实施培基连续灌流而只能采取批次培养方式。在培养的后期，部分细胞形成粒径不等的细胞团悬浮于培养体系中，细胞粒径≤25um 的 CHO2DS所占的比例下降为57.9%，不锈钢滤筒的细胞截留率升高至29.4%(图2)。整个培养过程持续6d，培养结束时 CHO2DS 细胞密度和凝血酶原浓度分别达到1.71×10°cells/mL 和 14.9mg/L(图3) 2.2 用改装的 Super-Spinner搅拌瓶连续灌流培养 CHO2DS在改装的1L Super-Spinner 搅拌瓶内用 Cytopore 1 固定 CHO2DS细胞，细胞接种密度和 Cytopore1的使用浓度分别万方数据 图2 CHO2DS细胞在改装的1L Super-Spinner 搅拌瓶内悬浮培养的单个细胞比例和细胞截留率 Fig. 2 Percentage of single cell and cell retention of CHO2DS cellsin a 1L modified Super-Spinner 图3 CHO2D5 在经改装1L Super-Spinner 搅拌瓶内悬浮培养的细胞生长和凝血酶原生产 Fig.3 Growth of CHO2DS cells and protrombin productionin a 1L modified Super-Spinner 为2.6×10°cclls/mL和2g/L、接种4h 后，CHO2DS细胞全部固定于 Cytopore 1 孔隙内、从采样管和培基灌流出液管获得的细胞培养上清中均无游离细胞存在。自培养的第3天起实施培基连续灌流，灌流量由250mL/d逐渐加大至1500mL/d。 CHO2DS细胞密度和凝血酶原浓度在培养的第9天分别达到4.62×10°cells/mL 和 11.3mg/L并在这一水斗维持了10d后趋于下降，至培养的第24天 CHO2DS细胞密度和凝血酶原浓度分别降至2.85×10° cells/mL 和7.2mg/L(图4)。当 CHO2DS 细胞达到较高的培养密度时，CHO2DS细胞占据了 Cytopore1孔隙并在其表面形成致密 图4 CHO2DS 细胞在改装的 Super-Spinner 搅拌瓶中连续罐流培养时的细胞生长和凝血酶原生产 Fig.4 Growth of CHO2DS cells and prothrombin production in aIL modified Super-Spinner with continuous perfusion 的细胞层(图5)。部分细胞从 Cytopore 1 脱落，进入不锈钢滤筒内随培基排出 Super-Spinner 搅拌瓶。在培养的后期不锈钢滤简内的游离细胞密度达(1.8-2.7)×10 cells/mL，CHO2DS细胞的截留介于91.3%-95.6%之间，由于在整个培养过程中实施了培基连续滋流并根据有关检测指标调整培基的流量，既保证了葡萄糖等营养物质的供给.在定度上起到控制乳酸的过度积聚的作用(图6). 图5 连续培养条件下固定于Cytoporc 1 的 CHO2DS细胞生长 Fig.55Growth of CHO2DS rells immm：bilizrd on Cytnpore 1 incontinuously perfused culturc A. Cells took up the inner spaceif iberarrieis(MTT stained)；B. Cells formed e compact layer and clumjis on thrsurfre of the carfiers 图6 CH021)S细在改装的 Super-Spinner 搅拌内连续灌流培养的葡萄糖消耗和乳酸积聚 Fig.6 Glucose consumption and lactate ucrumulatxan profiles in a 11.modfier Super Spinner with a perfused culture of CHIO2DS 3 讨 论 随若越来越多的临床使用剂量介于毫克和克级水平的单克隆抗体和酶成为基因工程药物开发和产业化的重点，动物细胞的高密度培养和长期培养将成为决定产品能否开发成功的关键技术因素。供氧不足、营养物质限制和毒性代谢产物细胞生长的主要细胞密度限制因素采用无气泡膜式通气管供氧和动态的培基连续液流是克服 以上细胞密度限制因素，提高细胞培养密度和培养时间的有效技术途径I Super-Spinner 搅拌瓶以绕于支架上的无气泡膜式通气管潜代传统的搅拌叶片，在磁力搅拌器的驱动下产生均匀悬浮细胞的流体动力的同时，提高了培养体系的供氧能细胞培养时将 Super-Spinner 搅拌施置于37℃、5%CO的培养箱内，以培养箱内含45%空气、5%CO的气体为气源，通过调节气泵的泵速和通气管内压力，在改善培养体系的供氧的同时又有利小维持培养体系中适适的pH。在1L的 Super-Spinner 搅拌瓶中用 DF6S批次浮培养CHO2DS，细胞密度达到1.92×10°cells/mL 采用过滤的方式截留细胞是连续灌流培养中最为有效的细胞截留手段。与静止的滤器相比，固定于搅拌轴的旋转滤器有利于克服滤网的堵塞1，细胞截留和滤网堵塞是存在于采用滤网截细胞的一对矛盾，孔径较小的滤网有利于提高细胞的截留率，但滤网堵塞的现象更易发生；孔径较大的滤网有利于克服滤网的堵塞，但往是以降低细胞截留率为代价。结合细胞固定化培养技术，采用大孔径滤网的旋转滤器截留细胞既能有效地截留细胞又可消除滤网堵塞现象的发生。Cytopore1是一种以纤维素为材料的多孔性细胞固定化载体，即使在低血清或无血清的培基中也能有效地固定贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞.实施长期连续流培养 以 Cytopore 1为细胞固定载体，在改装的 Super-Spinner 搅拌瓶实施无蛋白培基连续流培养，CHO2DS 的培养密度和培养时间分别达到4.62×10"cclls/mL 和24d。实验结果表明：尽管由于改装的 Supper-Spinner 搅拌瓶缺乏有效的溶氧和pH控制，限制了细胞培养密度的进一步提高、改装的 SuperSpinner搅拌瓶仍不失为简便实用的细胞连续灌流培养装置。 ( REFERENCES(参考文献] ) ( . 1 . 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The viable celldensity of CHO2DS and prothrombin concentration reached 4.62×10(cells.m/L) and 11.3(mg/L)respectively after 9days culture. Key words continuously perfused culture，recombinant CHO cell，prothrombin Received：June 28，2000* Correspondingauthur. Tel：86-10-63841526； Fax：86 10 63833521； F-mail：chenzl@nie. bmi. ac. en 生物工程学报 (双月刊，1985年创刊) 2001年1月 第 17卷 第1期 ( 编 辑 生物T程学报编辑委员会 (北京海淀中关村中国科学院微生物研 究所内邮编100080 Tel：62554303) ) 主 编 焦 瑞 身 承 办巾国科学院微生物研究所 出 版科 学 出 版 社 (北京东黄城根北街16号，100717) ( 印刷装订 中 学 计 刷 订购 处 全 国 各 地 邮 局 国内发行 北 京 市 报 刊 发 行 局 国外发行 中国国际图书贸易总公司(北京399信箱) ) 广告经营许可正：京东工商广广第0706号 Chinese Journal of Biotechnology ( (Bimonthly，Started in 1985) ) ( January 2001 Vol.17 No.1 ) ( Edited by Editorial Board o f C hinese Journal o f B i ote chnology (Zhongguancun，Haidian，Bcijin g 100080) ) ( Editor-in-Chief；JIAO Rui-Shen ) ( Sponsored byInstitute of Microbiology， Chinese Academy of Seiences ) Published byScience Press ( 16 DonghuangchenggenBeijie，Beijing 100717，China) ( Printed by Printing House of CAS ) Domestic Subscription All Local Post Offices in China ( Distributed by B e ijing Bureau for Distribution of News- papers and Journals ) ( Foreign Distribution China I n ternational B ook Trading Corporation ) ( (P.O.Box.399，Beijing 100044、China) ) ( http：//www.im.ac.cn/cjb )