NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性检测试剂盒 微量法

NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 360 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2、 试剂三：临用前加入 327 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：

MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约 0.05g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一37℃预热15min。

3、样本测定：

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中，充分吸打混匀后立即在 340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，尽量保持反应温度为 37℃。计算 ΔA=A1-A2。记录 ΔA 测定、ΔA 空白。（空白管测 1-2 管即可）

三、NAD-MDH活力单位的计算

注意事项：

1、 粗酶液的提取必须在 0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2、 实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。

3、 使用光径为 1cm 的微量石英比色皿时当初始读值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。使用 96 孔 UV板时当初始读值小于 0.4 或者 ΔA 大于 0.3 时建议稀释后测量。

4、 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用 96 孔 UV 板同时测多个样本。

实验实例：

1、 取 0.05g 大鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8484-0.3068=0.5416，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045，

按样本质量计算酶活得：

NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W=6431×0.5371÷0.05=69082 U/g 质量。

2、 取0.05g柳树叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1 测定-A2 测定=0.7796-0.6917=0.0879，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045，按样本质量计算酶活得：

NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W=6431×0.0834÷0.05=10727 U/g 质量。

3、 取 5μL 血浆直接按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8194-0.7959=0.0235，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045，按血清/血浆体积计算酶活得：

NAD-MDH（U/mL）=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白)=6431×0.019=122 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！