己糖激酶(HK)活性检测试剂盒 微量法

己糖激酶（HK）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入 18 mL 试剂一充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂 4℃保存一周；

2. 试剂三：临用前取 1 支加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周。

产品说明：

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 在微量石英比色皿或96孔板中加入180μL试剂二、10μL试剂三和10μL样本，混匀，立即记录340nm处20秒时的吸光值A1，比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应5分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

三、HK 活性计算

注意事项：

1. 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 不同匀浆组织中HK 活力不一样，做正式试验之前请做1-2次预试验，若ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min，使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！