NAD 激酶(NADK)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060909212455083](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060909212455083.png)
溶液的配制:
1、 试剂三:用时加入 3 mL 双蒸水,充分溶解,可分装保存,-20℃保存两周,禁止反复冻融;临用前取出一支稀释 100 倍使用。
2、 试剂四:用时加入 1 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;
3、 试剂五:用时加入 2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;
4、 试剂六:用时加入 2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;
5、 试剂七:用时加入 2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃避光保存;
6、 试剂八:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 0.986 mL 蒸馏水充分溶解,可分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
7、 试剂十:自备 95%乙醇;
8、 标准品:加入 1.9 mL 蒸馏水,即得 2 μmol/mL NADP 标品。临用前稀释 100 倍得 20 nmol/mL NADP 标准溶液备用。
产品说明:
NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内唯 一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化 NAD(H)以 ATP 或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD 激酶在合成 NADP(H)以及调节 NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。
NADK 催化 NAD+磷酸化,生成 NADP+;NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH;NADPH 通过 PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过其在 570nm 的吸光值大小可反映出 NADK 活性的大小。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细菌、细胞或组织样本的制备:
细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,95%乙醇调零。
2、 标准品的配制:按下表混合试剂三和标准品配制标准品
![image 2022060909222281644](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060909222281644.png)
3、 操作表:(在 EP 管中操作)
![image 2022060909223775521](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060909223775521.png)
![image 2022060909225003611](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060909225003611.png)
充分溶解沉淀后,放于微量比色皿或 96 孔板中在 570nm 下测定吸光值,分别记为 A 测定,A 对照,A 标准,A空白,计算 ΔA 测定=A 测定- A 对照,ΔA 标准=A 标准-A 空白。
三、NADK活性计算
![image 2022060909232490239](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060909232490239.png)
注意事项:
1. 样本的处理必须在 0℃-4℃中操作完成,以防止酶变性失活。建议在正式实验前,选取差别较大的两个样本进行预实验。
2. 试剂三、四、五、六、七、八在测定过程中都必须在冰上放置。
3. 当初始吸光值大于 0.4 时,建议将样本用 PBS 稀释后测量。
4. 若测量样本数量过多,可以将试剂二、五、六、七按比例配成工作液使用
实验实例:
1、 取 0.1 大鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清稀释 2 倍后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得 A测定=0.260,A 对照=0.125,计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.260-0.125=0.135,带入标准曲线 y=0.0994x-0.0429,计算 x=(0.135+0.0429)/0.0994=1.7897,按样本质量计算酶活得:
NADK(U/g 质量)=0.067×x÷W×稀释倍数= 0.067×1.7897÷0.1×2=2.3982 U/g 质量。
2、 取小鼠血浆稀释 2 倍直接检测,使用 96 孔板测得 A 测定=0.093,A 对照=0.076,计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.093-0.076=0.017,带入标准曲线 y=0.0994x-0.0429,计算 x=(0.017+0.0429)/0.0994=0.6026,按血浆体
积计算酶活得:
NADK(U/mL)=0.067×x×稀释倍数=0.067×0.6026×2=0.0808 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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