使用MANTIS®液体处理器，解决了处理单细胞样品特有的问题，提高了新工作流程的定量准确性量化单个哺乳动物细胞中蛋白质历来依靠免疫抗体技术，如CyTOF、单细胞免疫印迹和邻近延伸试验。尽管有效，但这些方法在生产通量上受到限制，且它们的准确性可能由于缺乏高度特异性抗体而降低。此外，和任何用于研究细胞的免疫分析方法一样，这些技术都面临着与细胞通透性和表位可及性相关的挑战。为了解决这些问题，东北大学斯拉沃夫实验室的研究人员最近开发了单细胞蛋白质组学质谱 (SCoPE-MS)，这是一种使用同位素标记定量 (TMT)标记单细胞多肽的技术。通过在纳米液相色谱分离之前将标记的肽与标记的载体肽混合， SCoPE-MS被证明可以极大地减少样品损失——当处理低丰度材料时如单细胞时，这是一个关键的考虑因素。对小鼠胚胎干细胞分化中的1000多种蛋白质进行定量分析，并将这些数据与mRNA表达进行比较，不仅为SCoPE-MS定 量表征单细胞基因调控奠定了基础，并且强调了它根据蛋白质组对细胞进行分类的潜力。随着自动化和小型化样品制备的引入2，SCoPE-MS已经发展成为SCoPE2。除了提供更好的定量精度外，SCoPE 2有利于降低成本、减少操作时间，显著提高样品制备和测量的通量。MANTIS®液体处理器(图1)是这一成功的关键，提供了可靠的亚微升容量分配，甚至是出了名难分配的液体，如用于存储TMT的100%乙腈。图1：MANTIS®液体处理器单细胞样品处理的独特挑战样本低通量是单细胞研究人员面临的主要问题。一个“正常”的哺乳动物细胞的蛋白质组通常 只有50-500pg，质量上限为广泛使用的HeLa细胞系，而像单核细胞这样的细胞含有较少的蛋白质。因此，进行一项实验需要将数十个、数百个甚至数千个样品结合起来，以获得足够的数量进行分析。反之，这给并行样本处理带来了挑战，必须确保将样本损失降到最低，以避免时间、资源的浪费。综合处理这些问题的方法斯拉沃夫实验室的研究人员已经确定了几种克服上述挑战的方法。为了解决低样品丰度的问题，设计了减少表面损失的措施，允许使用小体积样品。细胞裂解方法的改变省去了在质谱分析之前的清理步骤，这是现有质谱方法中的一个关键步骤，通常会损失大量的蛋白质。多孔板的使用有助于确保分析是可靠和稳健的。最后，自动化的引入是消除人工样本处理错误和增加通量的基础。SCoPE2工作流程为了解MANTIS®液体处理器是如何运用于SCoPE2中，掌握SCoPE2工作流程是很重要的(图2) 。下面展示的工作流总结，用橙色标出了使用MANTIS®液体处理器的阶段。SCoPE2 工作流程：用1 μL含25 pmol Waters MassPREPTM（一种简单的5肽混合物，有助于钝化塑料制品）的纯水制备384-孔板。使用细胞分拣器将单个细胞分配到孔板中，以实现随机布局(图3)，并在-80°C冷冻孔板。将孔板快速转到PCR机上，并在90°C加热10分钟溶解细胞。慢速旋转孔板，冷却，在水浴声纳器孵育5分钟，然后再次旋转。每孔加入0.2 μL主混合液（00mM TEAB, 10ng /μL胰蛋白酶，0.25单位/μL苯并酮酶），将蛋白分解为多肽，37℃孵化3小时。每孔加入0.5 μL 22 mM TMT（100%乙腈）标记多肽，室温孵化1小时。每孔加入0.2μL0.5％羟胺，淬灭任何未反应的TMT，室温孵化30分钟。使用多道移液管组合样品，转移到自动进样器玻璃插入瓶中，集中干燥。样品重新悬浮于1.2 μL 0.1%甲酸溶液中，用于LC-MS/MS分析。图2：SSsc工作流。使用MANTIS®液体处理器进行的步骤以橙色显示。使用MANTIS®液体处理器提高了定量准确性通过在原有的SCoPE-MS工作流程中引入自动化、小型化的样品制备，斯拉沃夫实验室的研究人员获益于显著增加的实验通量。使用SCoPE2，可在短短10天的仪器运行时间内量化1018个单个单核细胞和巨噬细胞中超过2700个蛋白质，量化的蛋白质允许通过细胞类型识别单个细胞。MANTIS®液体处理器是为SCoPE2工作流程四个关键步骤提供可靠的亚微升分配的重要组成部分，即为细胞分选板的准备、蛋白质分解、肽标记和TMT反应的猝灭。MANTIS®液体处理器的几个重要特性使SCoPE2选择了它，首先是它的单喷嘴结构和非接触式分配能力。由于每个孔包含不同的细胞类型（图3），必须避免交叉污染。图3:在MANTIS®液体处理器上分配的随机布局示例：绿色-载体，蓝色-细胞1型，红色-细胞2型，黑色-控制（无细胞）。MANTIS®液体处理器的理想特性是它与各种试剂的兼容性。虽然分配水溶液对大多数液体处理平台没有什么问题，但准确分配亚微升体积的困难液体，如100%乙腈（用于存储和稀释 TMT标签）是具有相当挑战性的。最后，通过高度直观的软件，可以方便且快捷地集成到现有的工作流程中，MANTIS®液体处理器使斯拉沃夫实验室的研究人员能够继续开发SCoPE2，不会因为仪器设置造成延误。

I. 介绍本实验步骤描述了在MANTIS®液体处理器上使用SMART-Seq单细胞试剂盒(SSsc kit, Cat. # 634472)进行 四分之一体积的反应，从384孔板的单细胞中生成cDNA。II. 概论使用SSsc试剂盒进行384次反应，精确计算如下试剂体积，为了确保有足够的试剂进行384次四分之一 体积的反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积。LV芯片灌注体积= 5.4 μlLV芯片预分配体积为=1.2 μlHV芯片灌注体积=12 μlHV芯片预分配体积=5 μl每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯 片。注意避免在整个过程中出现气泡。 有关SMART-Seq单细胞套件的更多信息，请参阅SMART-Seq单细胞套件用户手册。III. 实验步骤A. 用于细胞分选的384孔板的制备1. 为了制作CDS分选溶液(CSS)，首先手动注入114μl 10X裂解缓冲液到1.5 ml无核酸酶管中。2. 添加6μl核糖核酸酶抑制剂(40 U /μl)，通过缓慢混合后快速旋转试剂。3. 将120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A加入到10X反应缓冲液中(总体积为60μl)。4. 加1,260μl无核酸酶水(总体积1,500μl)。5. 缓慢旋转混合物。6. 将750μl的CSS注入两个1000μl的吸管剪短，并将尖端装入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通过对 MANTIS液体处理器编写程序，从选择的位置添加3.2μl CSS到每个孔中。注:在本实验方案中，我们假设FACS对细胞的分选不会改变板孔中液体的体积。如果分选机分配了不可忽略体积的鞘液 量，可通过减少无核酸酶水的量来调整CSS混合物的体积，使其总体积保持在3.2μl /孔。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。B. 细胞分类1. 将细胞直接注入含有CSS的板孔中。2. 分类完成后，将孔板密封，并将其快速旋转，使细胞到达孔的底部。3. 立即将孔板放置于干冰上约5分钟，然后转移到-80°C的冰箱。安全停止点：孔板可在-80°C保存过夜。C. 低聚糖退火1. 从-80°C的冰箱中取出孔板，让它解冻约1分钟，并轻微旋转。然后，向下旋转孔板，收集孔底的 内容物。2. 将孔板转移到预热过的热循环器中，在72°C孵化3分钟。3. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。4. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(D部分)。D. RT反应混合液的制备1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，制备足够的RT反应混合物，进行384次 反应。务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行384次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在1,000μl的移液管吸头加入804μl的RT反应混合也，装入LV MANTIS MANTIS液处理器编程，将1.9μl的RT反应混合液加入到选择的孔中。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。4. 以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。E. 第一链的合成1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序2. 程序完成后，以每分钟2000转的速度旋转平板30-60秒。安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。F. PCR扩增cDNA1. 将以下试剂按照顺序加入到2.0 ml冰管中，准备足够的384个反应的PCR反应混合液。请务必在 使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行384次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在6个1000μl的移液管吸头加入1030μl PCR主混合液，将每个吸头装入HV MANTIS 芯片(位置 1-6)。每1000μl的移液器吸头，使用MANTIS液体处理器编程，在E阶段制备的孔板每孔中加入 15μl的PCR主混合液。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。4. 以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。5. 将孔板转移到预热过的热循环器中，运行以下程序:*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。G. 用NucleoMag NGS纯化及片段选择纯化扩增的cDNAcDNA可以通过NucleoMag NGS的纯化及片段选择(Takara Bio, 744970.5, 744970.50，或 744970.500)纯化。注：NucleoMag NGS的纯化及片段选择磁珠悬浮可以用等量的agcourt AMPure XP磁珠代替。1. 每次使用前，取适量置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要100μl。3. 需要一个能容纳384孔板的磁力分离架。4. 将NucleoMag NGS的纯化及片段选择磁珠混合均匀，然后在每个样品中加16μl。5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直 至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。9. 把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后， 小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。14. 室温孵化2分钟以补水。15. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直 至液体完全清澈。16. 将含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品 信息标签，并在-20°C保存，直到库准备好。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。17. 参考SMART-Seq Single Cell Kit用户手册，了解量化和库准备选项。

I. 介绍本实验步骤描述了如何在MANTIS®液体处理器上使用SMART-Seq单细胞试剂盒(SSsc Kit, Cat)在96-孔板 上从单个细胞中生成cDNA (SSsc kit, Cat. # 634472)。II. 概论一个96-反应试剂盒提供了足够的试剂来执行这个实验方案。为了确保试剂有足够的数量进行96个全体 积反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:LV芯片灌注体积= 5.4 μlLV芯片预分配体积为=1.2 μlHV芯片灌注体积=12 μlHV芯片预分配体积=5 μl 每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。注意避免在整个过程中出现气泡。有关SMART-Seq单细胞套件的更多信息，请参阅SMART-Seq单细胞套件用户手册。III. 实验步骤A. 用于细胞分选的96孔板的制备1. 为了制作CDS分选溶液(CSS)，首先手动注入114μl 10X裂解缓冲液到1.5 ml无核酸酶管中。2. 添加6μl核糖核酸酶抑制剂(40 U /μl)，通过缓慢混合后快速旋转试剂。3. 加入120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A4. 加1,260μl无核酸酶水(总体积1,500μl)。5. 缓慢旋转混合物。6. 将750μl的CSS注入两个1000μl的吸管剪短，并将尖端装入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通过对 MANTIS液体处理器编写程序，从选择的位置添加3.2μl CSS到每个孔中。(每个孔将得到两份6.3 μl当量的CSS)注:在本实验方案中，我们假设FACS对细胞的分选不会改变板孔中液体的体积。如果分选机分配了不可忽略体积的鞘液量，可通过减少无核酸酶水的量来调整CSS混合物的体积，使其总体积保持在12.6μl /孔。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。B. 细胞分类1. 将细胞直接注入含有CSS的板孔中。2. 分类完成后，将孔板密封，并将其快速旋转，使细胞到达孔的底部。3. 立即将孔板放置于干冰上约5分钟，然后转移到-80°C的冰箱。安全停止点：孔板可在-80°C保存过夜。C. 低聚糖退火1. 从-80°C的冰箱中取出孔板，让它解冻约1分钟，并轻微旋转。然后，向下旋转孔板，收集孔底的 内容物。2. 将孔板转移到预热过的热循环器中，在72°C孵化3分钟3. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。4. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(D部分)。D. RT反应混合液的制备1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，制备足够的RT反应混合物，进行96次 反应。务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在1,000 μl的移液管顶端加入795μl的RT反应混合也，装入LV MANTIS 芯片上(位置3)。用MANTIS液体处理器编程，将7.5μl的RT反应混合液加入到选择的孔中。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。E. 第一链的合成1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序 :2. 程序完成后，以每分钟2000转的速度旋转平板30-60秒。安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。F. PCR扩增cDNA1. 将以下试剂按照顺序加入到15 ml冰管中，准备足够的96个反应的PCR反应混合液。请务必在使 用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在3个1000μl的移液管吸头加入1080μl PCR主混合液，将每个吸头装入HV MANTIS 芯片(位置 4-6)。每1000μl的移液器吸头，使用MANTIS液体处理器编程，在E阶段制备的孔板每孔中加入 10μl的PCR主混合液。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。4. 将孔板转移到预热过的热循环器中，运行以下程序:*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:5. 如下一阶段(阶段G)所示，可以使用Agencourt AMPure XP磁珠手工纯化cDNA。安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。G. 用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA1. 每次使用前，取适量置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要400μl。3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀，然后在每个样品中加40μl。5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直 至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。9. 把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后， 小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。14. 室温孵化2分钟以补水。15. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直 至液体完全清澈。16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信 息标签，并在-20°C保存，直到库准备好。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。17. 参考SMART-Seq Single Cell Kit用户手册，了解量化和库准备选项。

I. 介绍本实验步骤描述了在MANTIS®液体处理器上使用SMART-Seq单细胞试剂盒(SSsc kit, Cat. # 634472)进行半体积的反应，从96孔板的单细胞中生成cDNA。II. 概论一个96-反应试剂盒提供了足够的试剂来执行这个实验方案。为了确保试剂有足够的数量进行96个全体积反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:LV芯片灌注体积= 5.4 μlLV芯片预分配体积为=1.2 μlHV芯片灌注体积=12 μlHV芯片预分配体积=5 μl 每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。注意避免在整个过程中出现气泡。有关SMART-Seq单细胞套件的更多信息，请参阅SMART-Seq单细胞套件用户手册。III. 实验步骤A. 用于细胞分选的96孔板的制备1. 为了制作CDS分选溶液(CSS)，首先手动注入57μl 10X裂解缓冲液到1.5 ml无核酸酶管中。2. 添加6μl核糖核酸酶抑制剂(40 U /μl)，通过缓慢混合后快速旋转试剂。3. 加入120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II4. 加630μl无核酸酶水(总体积750μl)。5. 缓慢旋转混合物。6. 将750μl的CSS注入1个1000μl的吸管剪短，并将尖端装入LVMANTIS芯片(位置1)。通过对 MANTIS液体处理器编写程序，从选择的位置添加6.3μl CSS到每个孔中。注:在本实验方案中，我们假设FACS对细胞的分选不会改变板孔中液体的体积。如果分选机分配了不可忽略体积的鞘液 量，可通过减少无核酸酶水的量来调整CSS混合物的体积，使其总体积保持在6.3μl /孔。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。B. 细胞分类1. 将细胞直接注入含有CSS的板孔中。2. 分类完成后，将孔板密封，并将其快速旋转，使细胞到达孔的底部。3. 立即将孔板放置于干冰上约5分钟，然后转移到-80°C的冰箱。安全停止点：孔板可在-80°C保存过夜。C. 低聚糖退火1. 从-80°C的冰箱中取出孔板，让它解冻约1分钟，并轻微旋转。然后，向下旋转孔板，收集孔底的内容物。2. 将孔板转移到预热过的热循环器中，在72°C孵化3分钟3. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。4. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(D部分)。D. RT反应混合液的制备1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，制备足够的RT反应混合物，进行96次 反应。务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在1,000 μl的移液管顶端加入397.5μl的RT反应混合也，装入LV MANTIS 芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程，将3.8μl的RT反应混合液加入到选择的孔中。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。E. 第一链的合成1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序 :2. 程序完成后，以每分钟2000转的速度旋转平板30-60秒。安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。F. PCR扩增cDNA1. 将以下试剂按照顺序加入到2.0μl冰管中，准备足够的96个反应的PCR反应混合液。请务必在使 用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下轻轻混合。*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。2. 在2个1000μl的移液管吸头加入810μl PCR主混合液，将每个吸头装入HV MANTIS 芯片(位置4 和5)。每1000μl的移液器吸头，使用MANTIS液体处理器编程，在E阶段制备的孔板每孔中加入7.5μl的PCR主混合液。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。4. 将孔板转移到预热过的热循环器中，运行以下程序:*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:5. 如下一阶段(阶段G)所示，可以使用Agencourt AMPure XP磁珠手工纯化cDNA。安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。G. 用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA1. 每次使用前，取适量置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要400μl。3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀，然后在每个样品中加40μl。5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直 至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。9. 把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后，小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。14. 室温孵化2分钟以补水。15. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直 至液体完全清澈。16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信 息标签，并在-20°C保存，直到库准备好。安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。17. 参考SMART-Seq Single Cell Kit用户手册，了解量化和库准备选项。

引言：低输入RNA-Seq工作流程的试剂和反应体积的小型化和缩小，使研究人员能够在低样本输入和增加样本数 量的情况下工作。随着反应体积的减少，试剂体积的准确传递成为保持数据质量和技术重复性的关键步骤。我们展示用于测序和Illumina Nextera®XT工作流的Clontech SMART-Seq®v4 Ultra®低输入RNA试剂盒的 小型化结果，使用紧凑的桌面微流体分配技术生成高质量的RNA- seq样本。材料及方法：SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒SMART®技术(图1)是基于非模板核苷酸，当其在cDNA合成过程中达到mRNA的5 ‘端时，由基于mmlv的 逆转录酶(RT)添加。当一个特殊设计的带有与这些非模板核苷酸互补序列的SMART寡核苷酸与cDNA第一 链杂交时 ，就会发生模板切换。RT从使用mRNA作为模板转变为使用SMART 寡核苷酸进行进一步的cDNA合成。这确保了mRNA的5‘端 被捕获，并允许特定的序列被添加到cDNA的每个端，以更简单的扩增和丰富全长cDNA。图1.SMART cDNA合成技术。Mantis低通芯片分配MANTIS®是一个易于编程、低微量移液、低死腔容积、非接触式试剂分液设备。MANTIS可以配置多达24种 不同的试剂，有100nl – 2 ml的分配范围，可以分配任何体积到任何孔中，并兼容任意孔板，高达1536孔。为了减少死死腔容积，试剂可以直接连接到微流控芯片。更可通过使用移液枪头直接插在芯片上进一步减小 死体积到只有6μL。这个功能是分配NGS样品准备试剂的理想选择。图2. MANTIS®微流体分配系统cDNA合成和库准备10ng等份的小鼠大脑总RNA和等份1000个细胞(K562细胞系)和阴性对照样品使用标准全体积反应条件处 理，并与使用SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒缩小反应体积处理的样本进行对比。采用8个循环的PCR 扩增cDNA产物试剂体积如表1所示。使用片段分析仪(AATI)对生成的cDNA产物进行了表征，并通过 PicoGreen®assay进行了定量。表1. 全反应和小型化 cDNA合成反应试剂体积。使用MANTIS低通芯片分配缓冲液、引物和预混液试剂。使用缩减规模的反应体积的Nextera XT 片段文库试剂盒 (Illumina) )从 100 pg 等份的扩增 cDNA 产物中制备 Illumina 测序文库，如表 2 所示。与标准完整反应体积进行比较用于说明证实。小型化 Nextera XT 反应条件用于全规模和小型化 cDNA 合成样品。我们使用12个循环的PCR扩增测序文库。表 2. Nextera XT 片段文库制备试剂体积。使用 MANTIS® 低通量芯片分配试剂。小型化的cDNA合成和文库制备条件用于分别使用8、11、14、17个PCR周期处理1000个、100个、10个、1个 细胞样品的递减输入细胞（K562），如果样品中含有细胞，从减少的数量中扩增cDNA产物。测序与数据分析合并索引的样品，并使用MiSeq进行2x75 bp读数测序。用CLC Genomics Workbench（8.5.1版）对读数进 行调整，并使用CLC将其定位到rRNA和线粒体基因组。然后用CLC将未映射的读数映射到人类基因 组(hg19)和小鼠基因组(mm10)，通过RefSeq掩蔽，产生唯一的映射读数和%读数，映射到RefSeq注释， 包括外显子、内含子和基因间区域。每个文中鉴定的基因数由RPKM≥0.1的基因数确定。映射到RefSeq 后，使用CLC Genomics Workbench获得了不同基因的表达水平。结果：cDNA合成图3.电泳图，显示了用于全反应和小型化反应的cDNA产物的等量分布。表3.用Pico-Green测定测得的cDNA产物产量（ng/μl）。测序库准备图4.最终片段库的电泳图显示了细胞和RNA输入样本的全反应和小规模的 cDNA合成反应的等量分布。表3.用Pico-Green测定测得的cDNA产物产量（ng /μl）。测序结果-全反应和小型化反应的比较表4. 全反应和小型化反应条件的RNA-Seq数据分析比较。表5.用Pico-Green法测定cDNA产物收率(ng/Âμl)。表6. 使用小型化样品准备条件减少细胞数量的RNA-Seq数据分析。总结：使用Formulaonx Mantis微流控分液系统时，使用Clontech SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒减少 用于cDNA合成的试剂量，其结果可媲美全反应体积。从按比例缩小的反应体积的工作流程扩增的cDNA的平均产量与细胞和总RNA的输入样本兼容。RNA-Seq数据分析指标在全反应和小型化反应条件之间具有可比性。高产量cDNA合成化学与高精度小剂量试剂分配相结合，提供了非常适合大规模RNA-Seq研究的工作流程。

I. 目的本实验方案的目的是描述如何在1 / 4体积反应中，使用MANTIS在96孔板上制备和组合试剂，以构建高通量SMART-Seq v4 cDNA文库。II. 注意事项 下面指定的试剂体积是使用SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒按照本方案进行测序时精确计算得出的，该试剂盒用于测序，可在三块孔板上进行96次反应，每块板四分之一体积试剂，使用单一的96反应试剂盒(634891。为了确保试剂有足够的数量进行3x96个1/4体积反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:LV芯片灌注体积= 5.4 μl LV芯片预分配体积为=1.2 μl HV芯片灌注体积=12 μl HV芯片预分配体积=5 μl每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。注意避免在整个过程中出现气泡。有关SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒测序的更多信息，请参考试剂盒用户手册，可在takarabio. com/manuals获得。III. 实验方案A.反应缓冲液的制备1. 使用1.5 ml微量离心管，手动分配31μl的10X裂解液。加入RNAse抑制剂1.6μl，核酸酶游离水46.5μl。然后用旋涡轻轻混合，快速旋转试剂。B. 样品的制备1.在不含Mg2 +和Ca2 +离子的PBS中洗涤细胞，然后将细胞分配或分选到96-孔板的各个孔中，使每个细胞悬浮于2μl不含Ca2 + / Mg2 +的PBS中（更小的悬浮体积也在接受范围内，参阅步骤3）。2.在200ul移液器吸头中装入72.75ul反应缓冲液，然后将吸头装到LV Mantis芯片上（位置1）。对MANTIS进行编程，以从所选位置添加0.6 µl反应缓冲液。3.可选：如果步骤1中每个单细胞悬浮液的体积小于2 ul，则用200μl无核酸酶水填充200μl移液器吸头，并将吸头装到Mantis LV芯片上（位置6）。对MANTIS进行编程，以从选定位置添加足够量的无核酸酶水，以使每个孔的总流体量达到2 µl。对于阴性对照样品，在空的孔中加入2µl无核酸酶的水。4.在200ul 移液器吸头中装入60ul 3'SMART CDS Primer IIA，然后装到LV Mantis芯片上（位置2）。对MANTIS进行编程，以从所选位置添加0.5µl 3'SMART CDS Primer IIA（12µM）。5. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。C.低聚糖退火1.将孔板从B部分转移到预热的热循环器中，并在72度下孵育3分钟。2. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。3. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(下方D部分)。D.RT反应混合液的制备1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物，使用多10％体积的试剂，以及10uL灌注体积 进行溢出反应。2.在2,000µl的移液管吸头中加入208 ul的RT反应混合液，装到LV MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程，将1.9µl的RT反应混合液加入到选择的孔中。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。E.第一链的合成1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序 :F.PCR扩增cDNA1.将下列试剂在1.5uL管中冰上混合。务必在使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶。上下吹打轻轻混合。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物，使用足够进行12个溢出反应的试剂量（即总共108个反应）。2.在1,000 ul的移液管吸头中加入810 ul的RT反应混合液，装到MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程，将7.5 µl的RT反应混合液从选择的位置加入到96孔中。3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。4. 将孔板转移到预热的热循环器中，然后运行以下程序：*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:5. PCR反应完成后，在200µl移液管吸头中加入60µl的10X裂解缓冲液，并将吸头装到LV Mantis芯片上（位置1）。用MANTIS液处理器编程，将0.3 μl的10X裂解缓冲液加入到选择的孔中。6.如下一阶段(阶段G)所示，可以使用SPRI beads磁珠手工纯化cDNA。G.用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA1. 每次使用前，取磁珠等分液置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要100 μl。3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀，然后在每个样品中加13 μl。5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。9.把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后，小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所有剩余的乙醇。12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。14. 室温孵化2分钟以补水。15. 轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直至液体完全清澈。16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信息标签，并在-20°C保存。

将 MANTIS® 液体处理器引入现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中提高了通量并降低了成本全球范围的Covid-19传染导致了对大规模诊断测试的急切需求变得前所未有。在为检测和监测SARS-CoV-2 冠状病毒而开发的各种方法中，定量逆转录 PCR (RT-qPCR) 因其简单、灵敏性和可靠性而成为目前的首选方法。RT-qPCR 的另一个优势是它非常适合大规模操作，能够处理大量患者样本，而在一工作流程中可以加入自动化液体处理器。然而，由于许多自动化液体处理器有着较大的死体积和一次性吸头形式的高塑料制品要求，因此这样的实验进展可能会受到全球 RT-qPCR 试剂和自动化耗材供应短缺的限制。牛津大学 MRC Weatherall 分子医学研究所 (WIMM) 的研究人员为了解决这个问题，最近将MANTIS® 液体处理器集成到现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。非接触式分液显著减少了移液器吸头的使用，并且高精度的小容量分液为测定小型化提供了充足的机会，MANTIS 液体处理器不仅增加了通量，而且还降低了成本。通过与约翰拉德克利夫医院的合作证明了这种应对流行病方法的价值，在此，已知的 Covid-19 阳性和阴性样本在两种情况下的一致性 > 95%。图 1. 典型的临床测试工作流程临床工作流程需要扩大测试规模以应对不断增长的测试需求先收集患者拭子，然后使用 RT-qPCR 检测 RNA 病毒（图 1）的典型临床工作流程。然后将其带到封闭等级为 3 级的无尘室，之后将样品材料手动转移到含有裂解缓冲液的管中并加热以裂解细胞。接下来，在通过 RT-qPCR 扩增之前，通常使用基于移液器吸头的液体处理仪器从样品中提取 RNA。然后分析数据并将结果上传到实验室信息管理系统 (LIMS)。尽管这样的工作流程非常有效，但应对 Covid-19 需要大规模测试。这意味着我们需要将试管更换为 96 或 384 孔板，并使用大型自动化液体处理器来提高 RNA 提取和纯化的通量。此外，我们还必须采取措施简化 RNA 测序和后续数据分析。大型自动化液体处理器面临诸多挑战使用大型自动化液体处理器来增加 Covid-19 RT-qPCR 工作流程的吞吐量会面临的一个主要问题是不可避免地依赖制造商提供大量一次性塑料制品，尤其是专有吸头。随着全球需求飙升造成了供应短缺，许多实验室因此无法正常工作。此外，与使用吸头相关的高死体积意味着所需试剂的获取仍然是另一个关键限制因素。由于许多大型自动化液体处理器无法在微孔板格式之间轻松切换（例如 96 孔板到 384 孔板），在必须手动更换移液头时增加了工作流程的额外时间，因此会造成实验挑战。在涉及多种液体类别的情况下，缺乏可靠、一致的移液也会带来问题，特别是粘性试剂特别难以处理，并且通常需要重复测试，造成延误和成本增加。非接触式分液减少了塑料制品和试剂的使用为了克服使用大型自动化液体处理器处理患者样本带来的相关挑战，WIMM 的研究人员最近选择将 MANTIS 液体处理器（图 2）集成到现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。他们选择MANTIS 液体处理器的一个主要原因是该系统非接触式分液的能力，即使用可重复使用的微流控芯片代替移液器吸头，以准确分配液体，而且没有交叉污染的风险。MANTIS 液体处理器的占地面积小，这使得它能放置在生物安全柜内，从而确保研究人员在处理具有潜在传染性的患者样本材料时的安全。图 2. MANTIS® 液体处理器MANTIS 液体处理器的其他重要特性使其特别适合 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程，包括它能够准确分配各种体积 - 从低至 100 nL 到毫升量，具有极 低死体积 ，并且可以轻松地在不同的孔板格式之间切换。结合MANTIS 液体处理器能够处理许多不同类型的液体，它的这些功能为分析小型化提供了充足的可能性，而这是在使用昂贵的试剂（例如目前PCR 缓冲液供应有限 ）时的关键考虑因素。使用 MANTIS® 液体处理器提高 Covid-19 RT-qPCR 通量如果要了解研究人员如何使用 MANTIS 液体处理器来提高工作流程效率，那么了解 WIMM Covid-19 RT-qPCR 测定的执行方式就显得非常重要。简而言之，qPCR 探针（来自寡核苷酸供应商的 N1 和 N2 FAM 探针，或对照探针）在 TE 缓冲液中预混合，并使用 MANTIS 分配到384 孔板中。接下来，使用 384 通道移液器将样品 RNA 添加到探针中，进行微孔板板间的直接转移。之后使用市售的 RT 酶混合物进行逆转录，接着使用合适的实时热循环仪执行qPCR（图 3）。图 3. WIMM 高通量 COVID-19 RT-qPCR 工作流程与手动处理相比，通过将 MANTIS 液体处理器与 384 通道移液器相结合，可以在更短的时间内设置更多数量的微孔板；实验人员使用MANTIS，可以将 qPCR 探针在 4 分钟内添加到整个 384 孔板中。通过使用更大的试剂容器（例如 50 mL 离心管）可以进一步提高通量，并且在必要时，可以通过将反应板放置在位于仪器平台上的冷却 SBS 尺寸冷却模块上来保持反应低温。试剂分配的灵活性使测定小型化我们与 John Radcliffe 医院合作对 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程进行了改进。此次合作的总体目标是在不影响检测灵敏度的情况下减少试剂的使用，并要求在对 John Radcliffe 临床医生所提供的已知阳性和阴性 Covid-19 患者样本材料进行验证之前先完善 RT-qPCR 工作流程。最初，WIMM 研究人员评估了检测量减少所造成的影响。在早期测试数据（图 4）中可以看出，在单重测定格式中将 N1 和 N2 预混液的体积从 15 µL 减半至 7.5 µL 对灵敏度没有产生不利影响；在这两种情况下，该检测方法几乎都能检测到一个 Covid-19 RNA 拷贝。接下来，通过将 N2 探针与 Cy5 标记的对照探针（图 4）组合来评估 RT-qPCR 测定对多重测定的适用性，其中单独使用 N2 探针或与 Cy5 标记的对照探针组合生成标准曲线再次证明测定灵敏度没有明显变化。在这些实验成功之后，WIMM 研究人员使用修订后的实验方案对来自 96 个已知 Covid-19 状态的鼻咽拭子样本中的纯化 RNA 进行盲测。所有测试水平的结果都表明两个情况之间的一致性 > 95%，并且所有阴性样本都是非反应性的。图 4. 在全体积和半体积下进行的 N1 和 N2 单重测定显示出相似的灵敏度使用MANTIS® 液体处理器完善了工作流程，这已得到验证通过将 MANTIS 液体处理器集成到 Covid-19 RT-qPCR 的现有工作流程中，一致且可靠的非接触式分液提高了通量并消除了对制造商专有吸头的依赖——这意味着全球供应短缺不再是阻止 RT-qPCR 测定以所需容量运行的障碍。MANTIS液体处理器在减少检测量、显著节省成本以及在试剂短缺时避免延误等方面也发挥了关键作用。最后，MANTIS 液体处理器通过处理多重测定所需的复杂移液操作，确保即使是那些没有使用自动化液体处理器经验的人也可以轻松地进行多因子 RT-qPCR 实验。

背景人类白细胞抗原 (HLA) 系统是我们适应性免疫系统的一部分，在疾病防御和器官移植中都发挥着重要作用。带有与受者匹配的 HLA 标记的供者排斥器官的几率较小。荷兰拉德布德大学医学中心的医学免疫学实验室 (LMI)的研究者从潜在器官受体的血清中筛选出 HLA 特异性抗体。为避免供体器官的超急性排斥，检测针对 HLA 标志物的抗体是必要的。排斥可能是由输血、移植或怀孕引起的。该实验室每季度进行一次筛查，以检测患者血清中的这些有害抗体。可以通过将一名患者的血清与来自具有不同 HLA 标记的不同个体的 60 多种独特的淋巴细胞悬浮液进行交叉匹配，来检测这些抗体。这也称为补体依赖性细胞毒性 (CDC) 测试。在这项研究中，FORMULATRIX®的MANTIS®液体处理器用于将分离好的淋巴细胞分配到准备好的 Terasaki 板中。材料和方法首先，使用 ART Robbins (Sunnyvale, CA) 血清分配器将 1μl 患者血清分配到 Terasaki 板 (Greiner) 中。使用密度梯度 Lymphoprep (Elitech Group) 或液氮方法从血液中分离供体淋巴细胞，然后用 CFDA C195 (Invitrogen) 染料培养并洗涤。然后制备每毫升 4 x 106 个细胞的淋巴细胞悬浮液。MANTIS® 分液器用于将 1 μL 分离的淋巴细胞分配到准备好的 Terasaki 板中。之后的步骤包括添加兔补体 (Immucore, Norcross, GA) 和 EDTA (Merck, KGaA, Darmstadt, Germany)、血红蛋白和碘化丙啶的悬浮液，并进行培养。在最后添加步骤之后，在倒置荧光显微镜（Leitz Leica Diavert Inverted Microscope withfluorescent light illuminator (480-525nm) Oculair 10x）下观察微孔板以确定患者血清和供体淋巴细胞之间是否存在阳性或阴性反应。根据荧光染色结果确定杀灭百分比 (% kill) 的测量结果（参见图 1）。杀灭百分比是阳性细胞（红色）占阳性和阴性细胞总数（绿色）的百分比。百分比得分如表 1 所示。表 1: 杀灭百分比得分图 1: 明显易观察的淋巴细胞样本 (A) 阴性反应，绿色。 (B) 阳性反应，红色。 (C) 强阳性反应，红色结果与结论由于现有设备不再受到支持，因此实验室必须找到一种替代的自动分液器，用于将准备好的淋巴细胞添加到 Terasaki 板中。手动分液在实验过程中会引入可变性量，这对于研究者而言是不可接受的。越来越多使用不再受支持的设备进行 HLA 筛查的实验室将需要更换这种过时的技术，因此 LMI 的团队同意分享他们的评估结果，以使参与这项重要工作的更广泛的学术圈受益。 与手动移液器加液相比，FORMULATRIX公司的 MANTIS 仪器被认为是一种用于添加淋巴细胞的优越技术，并已成功应用到实验室的常规工作流程中。它能在更短的时间内获得结果，并且具有更高的一致性和准确性。感谢和致谢FORMULATRIX®非常感谢Yvonne van Berkel（senior analyst Cellulaire Immunologie en Histocompatibiliteit）和 LMI 团队在评估 MANTIS® 分液器的 HLA 工作流程方面所做的工作，以及在本应用说明中提供的数据结果。该团队的其他成员为Siham Akdimi、Gaby Derksen、Suzanne Hendriks 和 Jeroen Slager。

介绍:突触连接的改变与几乎所有的脑部疾病有关。尤其是，突触丢失是破坏认知功能的脑部疾病的一个特别严重的问题，例如精神分裂症和阿尔茨海默病。高内涵、基于初级神经元的筛选平台作为研究计划的一部分已被研发出来，其旨在发现引发神经连接数量增加的新机制以作为对抗这些疾病的策略，同时促进引发突触连接数量增加的新化学探针的研发。这些探针将作为未来几代治疗各种脑部疾病药物的开发平台。 作为高内涵筛选平台的一部分，为了确保批次间结果的可重复性，必须保证所有细胞接种一致，并且在实验期间保持细胞活性。本应用说明介绍了一个实验程序，强调了MANTIS® 液体处理器作为一种精确、可靠和强大的解决方案的适用性，即使是最敏感的原代神经元细胞也可以进行分配。材料: 1x PDL 涂层 1536 孔 Aurora 微孔板50 mL 培养基，含有:•  1X Neurobasal-A 培养基•  2.5% Glutamax-I•  02% Gentamicin 试剂 •  2% B-27 补充剂•  10 uM FUDR从 P0 小鼠幼崽中提取的5x106 个原代皮层细胞 FORMULATRIX® MANTIS 液体处理器Eppendorf 5810 R 离心机GE IN Cell Analyzer 6000 基于激光的共聚焦成像平台方法:1. 神经元细胞在 1536 孔 Aurora 微孔板上接种2. 将含有 3 x 103 个细胞的 15 μL 培养基分配到 1536 个孔中的每个孔中3. 将微孔板在 200 g 离心力下离心 1 分钟4. 细胞在不饲养的情况下培养 7 天 5. 使用 IN Cell Analyzer 6000 通过 DIV7 Phase Contrast 对细胞进行计数结果:培养 7 天后，平均相细胞计数与 96 或 384 孔板相当，整个 1536 孔板的细胞计数均匀性 CV 小于 10%。图 1. 1536 孔 Aurora 微孔板单孔中的原代神经元细胞总结: 即使是分配至小体积的 1536 孔板，Formulatrix MANTIS 也能够一致地分配细胞。此外，通过使用温和、低剪切力的分配技术，该仪器可延长体外细胞活性。致谢: 这项工作是由佛罗里达州木星斯克里普斯研究所的 Chris Hubbs 完成的。斯克里普斯研究所 (TSRI) - 世界上最大的私人非营利研究机构之一——站在基础生物医学科学的前沿，是医学研究的重要组成部分，旨在理解生命的最基本过程。在过去的几十年中，该研究所对为健康和人类状况改善做出重大贡献方面进行了长期的记录。

介绍: 核酸定量是分子生物学工作流程中的一个重要步骤，特别是对于qPCR 和下一代测序 (NGS) 等高级应用而言。在 NGS 中，最终目标是生成高度复杂的文库，并以最大程度的深度和均一性进行测序，因此准确定量尤为重要。准确测定核酸浓度的两个关键步骤是：1) 在最大酶效率对 DNA 输入量敏感的文库制备前和 2) 在文库制备后标准化样品以在测序前汇集。此外，对越来越少的样本输入（例如，用于 RNA-seq 实验）的需求以及从许多常见样本类型（如 FFPE 和ccfDNA）中分离核酸的挑战使得浓度估计变得困难。虽然存在多种定量方法，但基于荧光染料的系统因其灵敏度、目标选择性、成本和易用性而被推荐用于高级下游应用。使用QuantiFluor® dsDNA 系统，荧光染料原液被稀释形成工作溶液，添加到含有少量体积的纯化 DNA 样品的微孔板中，并使用荧光计测量荧光。灵敏且准确的 QuantiFluor® dsDNA 系统可用于定量单管以及96 孔和 384 孔板中的 dsDNA。 要保证小体积重复移液过程中的准确性会是件困难的事，而且过程中劳动密集，会出现失误和代价高昂的返工情况。因此，大多数需要更高通量的实验室选择用自动化机器人液体处理平台来进行定量分析。MANTIS® 是一种新型台式液体处理器，可满足高通量试剂分配的许多要求，而其成本仅为大型系统的一小半。对于核酸定量，MANTIS®可准确分配少量体积的 QuantiFluor® 染料工作溶液，以获得可重现的定量结果。在本应用说明中，我们展示了 MANTIS® 液体处理器的兼容性，它可以快速准确地自动化进行 96 孔和 384 孔板格式的 QuantiFluor® dsDNA 系统的试剂处理。所需材料• MANTIS® 仪器 (Formulatrix)• 大容量芯片 (Formulatrix Cat.# MCHS6)• QuantiFluor® dsDNA 系统 (Cat.# E2670)• 无核酸酶水 (Cat.# P1195)• 黑色平底 96 孔板(Corning Cat.# 3915) 或384 孔板(Corning Cat.# 3573)• 15ml 或 50ml 锥形管• 可测量荧光的多孔检测仪 (e.g., GloMax Discover System [Cat.# GM3000])实验方案: 试剂制备: 1. 制备 1X TE 缓冲液: 用无核酸酶水将 20X TE 缓冲液稀释 20 倍。2. 制备 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液。a. 96 孔格式：在 1X TE 缓冲液中按 1:400 稀释 QuantiFluor® dsDNA 染料。有关详细使用说明，请参阅QuantiFluor® dsDNA 系统技术手册 #TM346。b. 384 孔格式：根据您所需的分析要求进行染料稀释。（请参阅使用 QuantiFluor® dsDNA 系统进行高通量、低体积 DNA 定量应用说明，了解如何选择合适的染料稀释度 。 ）这里我们在1X TE 缓冲液中使用 1:200 稀释的 QuantiFluor® dsDNA 染料来定量 0.05–50ng DNA。3. 制备标准曲线: 使用已知浓度的 dsDNA 标准品和 1X TE 缓冲液进行连续稀释，该缓冲液在任何未知样品的浓度范围上下延伸。对于空白样品，使用 1X TE 缓冲液。仪器设置: 4. 打开 MANTIS® 桌面应用程序并选择“文件”>“新建分配列表”。从列表中选择您的测定板。5. 软件将提示用户将试剂添加到分配列表中。在“试剂名称”字段中输入“QuantiFluor dsDNA”，完成后选择“确 定”。6. 将 QuantiFluor dsDNA 分配到芯片位置 #17. 将 QuantiFluor® dsDNA 工作溶液置于芯片位置 #1 的试剂架中。将试管从芯片放入试剂中。8. 充注芯片并设置新的液体分配，具体做法为选择所需的孔并输入所选孔的目标体积a. 96 孔格式：将 200 µl 工作溶液分配到每个孔中。b. 384 孔格式：将 36 µl 工作溶液分配到每个孔中。9. 将微孔板添加到 MANTIS®deck 并按下 。分析测定：10. 手动将标准品、空白和未知样品移液到多孔板各自的孔中。c. 96-孔格式: 添加 1–20 µl 标准品、空白和未知样品。d. 384-孔格式: 添加 4µl 标准品、空白和未知样品。11. 使用摇板器或通过移液器移液每个孔中的液体将微孔板彻底混合。未能充分混合将导致孔之间的读数变化。还要避免引入气泡，这会干扰荧光。12. 在室温下培养测定物5 分钟。13. 检测荧光 (504nmEx/531nmEm)。如果使用 GloMax® Systems 检测仪器，请选择预加载的方案：“QuantiFluor dsDNA 系统”。14. 计算 dsDNA 浓度如下：从每个标准和样品荧光中去除空白样品（1X TE 缓冲液）的荧光。使用来自DNA 标准的校正数据生成荧光与 DNA 浓度的标准曲线。通过线性回归或幂回归确定标准曲线中任何未知样品的 DNA 浓度。标准化:15. 来自 GloMax® 检测仪器的浓度值可以直接导入 MANTIS® 软件，以计算标准化所需的体积（参见图 1 和图2）。图 1. 使用 MANTIS® 液体处理器分配 96 孔板（图 A）和 384 孔板（图 B）中的 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液，对K562 人类基因组 DNA 标准品（Cat.# E4931）进行定量。在 GloMax® Discover System 上测量荧光，并从幂回归标准曲线内插入未知样品。图 2. 用于模拟 mRNA 转录本平均大小的 2,200bp PCR 产物的定量。 Mantis 液体处理器用于分配 96 孔板形式（图 A）和384 孔板形式（图 B）的 QuantiFluor® dsDNA 系统。在 GloMax® Discover System 上测量荧光，并从幂回归标准曲线内插入未知样品。总结MANTIS® 液体处理器为研究人员提供了一个灵活的工作站，可在几分钟内建立各种实验方案。精确执行这些方案以提高实验室效率和实验重现性。本应用说明展示了液体处理软件的易用性，它可快速无缝地过渡到自动化平台。使用 MANTIS® 液体处理器为 QuantiFluor® dsDNA 系统添加试剂可在多层微孔板中实现可重现的定量，几乎无需仪器编程。

介绍: 核心实验室在提供与广泛的客户、样本类型和测序方法相关的各种下一代测序(NGS) 服务时，必须平衡好其 NGS 工作流程的效率与他们生成的数据的质量。随着测序成本的下降，与文库制备相关的费用开始成为整个 NGS 工作流程成本的大头。为了解决测序中的这一主要费用问题，许多机构跟随了反应小型化的趋势，有效地将反应体积减少到制造商推荐体积的 10%。本应用说明重点介绍了即使在低细胞输入的情况下也能通过精确的正排量微流控试剂分配生成高质量 NGS 文库的工作流程。四分之一体积的 Illumina Nextera XT 文库制备的质量控制数据展示了反应小型化在单细胞测序背景下的适用性和有效性。材料: Eppendorf twin.tec 384 板 (PN 0030129342)Illumina Nextera XT DNA 文库制备试剂盒 (PN FC-131-1096)Illumina Nextera XT 索引试剂盒 V2 (FC-131-2001)热循环仪FORMULATRIX® MANTIS® 液体处理器 (PN MANTV3.2)Alpaqua 384 柱式磁板 (PN A001222)ThermoFisher Qubit 4 荧光计 (PN Q33226)Agilent 2100 Bioanalyzer (PN G2939BA)方法: 四分之一体积的 Illumina Nextera XT 文库制备在该试点项目中使用了 8 个小鼠神经元细胞 cDNA 样本（3 种细胞类型；1 ng 的input DNA ），然后通过以下实验方案评估以四分之一体积产生的文库的质量：A. Tagment cDNA – 总反应体积为6.35 µL 1. 在 384 孔微孔板的孔中加入 1.25 µL input DNA。2. 将 TD 缓冲液吸入 200 µL 移液器吸头*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。将 2.5μL 的 TD 缓冲液分配到MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。3.混合。4. 将 ATM 吸到 200 µL 移液器吸头*中，然后置于 MANTIS 的 LV 芯片上。将 1.3μL 的 ATM 分配到MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。5. 混合。6.热循环:    i. 55℃下保持5 分钟    ii. 之后一直保持10℃7. 将 NT 缓冲液吸入 200 µL 移液器吸头*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。将 1.3µL 的 NT 缓冲液分配到MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。8.混合。9.室温培养 5 分钟。B. 文库扩增– 12.65 µL 总反应体积1. 将 NPM 吸入 200 µL 移液器吸头*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。将 3.8 µL 分配到MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。2. 手动移取 1.25 µL 两种index primer置于样品中，以便每个样品获得独特的index primer组合。3. 混合。4. 热循环:   i. 72℃下3分钟   ii. 95℃ 下30秒   iii. 以下做12 次循环         a. 95℃下 10 秒         b. 55℃ 下 30 秒         c. 72℃ 下 30 秒   iv. 72℃下5 分钟   v. 一直保持10℃C. 文库清理1.将 AMpure XP 微珠吸入 200 µL 移液器吸头*，然后置于 MANTIS 的 HV 芯片上。将10 µL 分配到MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。2.混合。3.室温培养5分钟4.将微孔板放在磁上，等待 2 分钟5.手动去除所有上清液（在第 11 步之前不要从磁上取下微孔板）6.在 MANTIS 上使用持续流功能选项，将 50 µL 80% EtOH 添加到微孔板上含有样品的每个孔中。7.培养30秒。8.手动去除所有上清液，同时将微孔板置于磁上。9.重复步骤 6-8。10. 风干 15 分钟。11. 从磁上取下微孔板。12. 将 RSB 吸到 200 µL 移液器吸头*中，然后放在 MANTIS 上的 HV 芯片上。13. 分配15 µL至MANTIS微孔板上含有样品的每个孔中。14. 混合。15. 在室温下培养 2 分钟。16. 将微孔板放在磁上。17. 培养 2 分钟。18. 手动将 12.5 µL 从微珠转移到新微孔板上。D. 吸入量 = 每个样品的分配量 x 样品数量 + 10% 安全系数。 当吸入量大于 200 µL 时，请使用 1000 µL 移液器吸头。结果: 通过 Agilent BioAnalyzer 的追踪评估每个样品的 Nextera 文库质量。图 1. 从 8 个独特的 1ng 鼠神经元细胞 cDNA 样本制备的 8 个下一代测序文库的 Bio nalyzer 追踪总结: 根据BioAnalyzer 数据追踪，通过四分之一体积反应小型化制备的文库组成是可以接受的，并且与按照全体积实验方案制备的文库组成相当。以四分之一体积制备文库可显著节省每次反应试剂盒成本的 75%。 FORMULATRIX® 的MANTIS® 液体处理器通过以低至 100 nL 的体积进行精确的微流控试剂分配，促进反应小型化，并且无耗材、使用简单且可靠。

【公司简介】 Formulatrix是一家正在快速成长的公司，总部位于美国麻省的 Bedford，2002 年以软件起家。公司现在已经成为了蛋白质结晶自动化硬件和软件解决方案的全球领导者。除了蛋白结晶仪器，我们还开发了专有的点样技术的仪器，来满足各大实验室对自动移液不断扩大的需求。【招聘需求】我们正在寻求一位能拓展液体点样产品线的销售。该职位涵盖的区域以中国为主。这个职位需要一个在快节奏的工作环境能够实践操，组织和注重细节的人。应聘者需能够非常擅长电话销售，学习我们产品的技术细节，并能单独为客户提供技术示范。【任职资格】l 性格友善，具有优秀的人际交往能力l 3 年或以上工作经验，生物基因领域最佳l 优秀的口头及书面沟通技能l 语言要求：母语为普通话，可以用英语进行交流l 对技术感兴趣及具有一定的悟性 - 你应该能很快学会的产品的技术操作，并给予令客户信服的演示l 熟练操作电脑的技能l 反应迅速并有条不紊。在我们的市场中，信誉就是一切，对此我们非常严肃。这要求销售人员及时响应每一位客户的需求，并完成对客户的承诺l 做事积极。希望你能全权负责从确定新的客户，跟进线索，演示，提供报价，谈判定价，到跟进采购，并过渡到售后的安装和支持团队。需要提醒的是电话销售是工作的一部分而且你应该能非常适应此项技能。l 需要参加展会和前往客户现场做产品演示具有结构生物学学位或其他科学或技术领域学位的应聘者优先，有从事科学仪器销售或相关经验者也优先。我们将对合适的人选提供全面的培训。【公司福利】13薪+年底奖金+销售提成+话费补贴+五险一金+商业保险+子女福利【简历投递】请有意向者将中英文简历发送至邮箱：lina.zhao@formulatrix.com 

将MANTIS®液体处理器与PlatePlan软件搭配使用，提高了高组合筛选工作流程的效率，从而提供了新的见解组合筛选是识别优化方案条件的有效方法。它用于并行研究多个因素，包含旨在评估少数参数如何影响可量化指标的相对简单实验，比如细菌生长，以及极其复杂的研究，比如留一法 (L1O) 和留二法培养基优化。不可避免地，随着评估因素数量的增加，设计和进行组合筛选变得更具挑战性。因此，先进的软件系统和液体处理器对于简化组合筛选工作流程和最大程度地降低错误风险显得至关重要。来自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究人员通过将 MANTIS® 液体处理器整合到已建立的深度表型分析工作流程中，能够运行以前由于需要大量移液操作而无法实现的组合筛选。将 Jenssen Lab 编写的 PlatePlan 软件与 MANTIS® 配对，最大限度地缩短了从实验设计到得出结果之间的时间。这对于在加快的时间范围内执行 L1O 和 L2O 实验至关重要。反过来，提高的工作流程效率提供了对共享相同代谢网络的不同菌株的氨基酸需求的新见解。组合筛选的复杂性各不相同根据所涉及的复杂程度，组合筛选可大致分为两类。低组合筛选的计划和执行相对简单，因为它们只需要在测定板的定义孔中添加一些不同的成分。高组合筛选更具挑战性，通常需要进行数千种不同的移液操作。50 种不同小分子的成对筛选是低组合筛选的典型示例，向每个孔添加两种化合物相当于1225 种不同的条件，或 2450 次移液操作。相比之下，具有 50 种不同成分的生长培养基的 L2O 筛选是高组合筛选；它包括在每个孔中添加 48 种不同的成分，相当于超过58,000 次移液操作（图 1）。图 1. 低组合筛选 VS 高组合筛选。培养基筛选提出了独特的挑战复杂程度并不是刚刚所描述的两个示例之间的唯一区别；所研究材料的性质也是一个重要因素。所提供的小分子通常是以 DMSO 或其他溶剂中的毫摩尔储备液形式，然后在测定中稀释至纳摩尔浓度。因此，任何溶剂的影响都可以忽略不计，无需为考虑向测定板添加小分子而减少工作体积。 所提供的培养基成分同样是以毫摩尔储备液的形式存在。然而，由于它们通常是帮助细胞生长所需的毫摩尔浓度的关键代谢物，因此它们占工作体积的比例要大得多。因此，将它们添加到测定板会影响 pH、盐浓度和其他培养基成分的溶解度，使培养基筛选比筛选小分子更困难（图2）。图 2. 小分子筛选 VS 培养基筛选。MANTIS® 液体处理器改善了深度表型分析工作流程伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究人员开发了一种内部深度表型分析工作流程，用于执行各种高通量筛选。在 PlatePlan 软件的支持和 MANTIS® 液体处理器的加入使用下，这一流程得到改善加强，从而能够轻松执行大规模组合 L2O 培养基优化。简而言之，深度表型分析工作流程包括四个关键步骤：实验设计；计划和调度；实验执行；和原始数据处理，如图3所示。图3. 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校开发的深度表型分析工作流程。要使用深度表型分析工作流程执行 L2O 培养基优化，用户首先将储备溶液的浓度和所需的最终浓度以及工作体积、最大分辨率（最小分配体积）、重复次数/对照、细菌类型、布局方案、机器人配置和生长条件等参数输入到 PlatePlan 软件中 。PlatePlan软件然后使用这些信息来进行操作计划，将储备溶液浓度转换为体积，并确定哪些试剂将分配到哪些孔中。接下来，一组技术人员和液体处理机器人在收集数据并将其提供给最终用户进行分析之前执行实验。在深度表型分析工作流程中，MANTIS®液体处理器的五个关键特性是其被选择的关键。首先，非接触式液体分配可实现无污染的液体处理，而且多余的塑料耗材要少得多。每次实验可节省数千个移液器吸头，极大地促进了更加具有生态和经济效益的工作流程。其次，精度对于在广泛的体积范围内进行如此多次数的移液操作至关重要。从任何类型的储液器中分配离散体积可实现至少100nl的一致液体处理，没有上限。而MANTIS能够以 3% 的 CV 分配 100nl的溶液。 第三，由于L2O实验中使用的储备溶液种类繁多，该系统必须与多种液体类型兼容。MANTIS®液体处理器通过轻松适应不同液体类别的粘度和溶剂浓度，能够轻松适应移液条件。 第四，试剂配料提高了工作流程效率。通过使用 MANTIS® 大容量芯片更换器 (LC3)，设置和分配时间显著缩短，因为可以预加载多达 48 种试剂。这大大降低了操作员失误的风险。图 4. MANTIS® 可以在任一一侧使用大容量芯片更换器 (LC3) 进行扩展。一个 LC3 可容纳 24 个芯片并包含24 个 15 mL 锥形管的适配器。通过在两侧扩展，MANTIS® 可容纳多达 48 种不同的试剂。最后，MANTIS® 液体处理器具有开放的 API，可轻松与 PlatePlan 或其他设计实验软件应用程序集成。这是避免由于软件重新配置而导致长时间延迟的关键所在，并且能够让L2O 实验几乎即时运行。工作流程效率的提高帮助获得新的见解自从将 MANTIS® 液体处理器集成到深度表型分析工作流程中以来，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究人员每周能够进行大约3,500次培养基生长测定，相当于大约80,000 次移液操作。这包括在不到 2 周的时间内使用两种不同的条件对 4 种不同的细菌菌株进行 L1O 和 L2O 氨基酸实验。通过提高工作流程效率，MANTIS®液体处理器使研究人员能够同时研究更多的实验参数；这反过来又揭示了新的见解。例如，通过快速生成已知在口腔微生物群中共存的四种不同细菌种类的 L2O 图谱，研究人员发现，尽管共享相同的代谢网络，但这些细菌具有非常不同的氨基酸需求。这可以在图 5 中看到。图 5. 四种不同链球菌物种的 L2O 图谱显示 S. gordonii 的氨基酸需求量最高，而 S. sanguinus 最少。总结生物系统非常复杂，只有考虑到会遇到的大量组合因素才能完整地对其进行研究。研究人员使用 PlatePlan 和 MANTIS® 液体处理器实现深度表型分析等高通量工作流程，能够轻松、精确地执行高组合筛选，例如 L2O 培养基优化，并且由于没有大量移液器吸头消耗而节省了大量成本 。这一工作流程揭示了新的见解，而不会因为可能会因孤立地筛选较少的因素而被遗漏。

使用Antha软件平台增强MANTIS®液体处理器的功能为了最大限度地提高使用细胞系统生产的各种生物制剂的质量和产量，研究人员需要一直优化生长条件。这涉及操纵多种生长培养基和过程变量（因子）以确定它们如何影响质量目标产品概况 (QTPP)，并且生长条件优化实验传统上都是使用单次单因子 (OFAT) 方法。尽管OFAT被广泛使用，但只有在所研究的变量因子不相互影响的情况下，OFAT 才真正有效。但在实际工作中，不相互影响的情况很少见。为了克服OFAT的局限性，作为一种更复杂方法的试验设计法(DoE)走上台前，研究者用它来并行研究多个因子并揭示这些因子是如何相互关联的。然而，尽管 DoE 有很多地方优于 OFAT ，但由于操作经验的缺乏和液体处理的复杂性以及速度和通量这些会立刻变化的多因子限制，它在生物技术行业的使用受到限制。为了克服这些挑战，我们将Synthace的Antha软件平台的实验操作计划和数据管理功能与FORMULATRIX的高速自动化MANTIS®液体处理器相结合。DoE不再是一项重大挑战，研究人员现在可以有效地开展 DoE 活动。使用eGFP的生产作为一个生物产品的指标，经实验证明，一个有着12变量因子的 DoE 涉及1298次独特的实验运行和近10000 个液体处理步骤，可以在3周内仅通过3次 DoE 迭代优化生长条件，使eGFP得到 5 倍 增产。DoE 使同时研究多个实验变量成为可能科学实验传统上依赖于OFAT方法，即除了正在研究的因子外，实验装置中的所有内容都保持不变。这种方法的问题在于，按顺序处理不同的实验参数会阻碍研究人员看到它们之间的相互作用，这种相互作用通常发生在许多生物系统中。这可能导致为下游研究选择次优条件，并限制对所研究系统的科学洞察力。DoE克服了OFAT 方法的局限性，能让研究人员同时研究许多不同的实验因子。这不仅增强了对所研究因子 如何在多个维度上相互作用并影响正在研究过程的理解，而且还增加了找到稳健的最佳条件的可能性（见图 1 ）。尽管与 OFAT 相比，DoE 提供了卓越的洞察力，但它的实验执行通常不容易通过自动化实现。例如，一个典型的全因子实验按 2n 指数扩展（其中 n 是要研究的因子的数量）。在扩展方面其他更高效的设计都可能面临类似的挑战，这意味着即使可以使用自动化液体处理器，DoE 执行的实验计划也会迅速变得笨拙。与 OFAT 实验不同，DoE 从根本上说是一种优化方法，它提供了对关键工艺参数 (CPP) 及其对生物生产过程的关键质量属性 (CQA) 的影响的理解。DoE实验的每个部分都能让实验者在他们对所研究系统的科学理解之上进行构建。通过使研究人员能够通过使用 DoE 来利用更多的科学见解，旨在简化 DoE 实施的解决方案正在科学界得到广泛采用，因为它们为实验研究提供了更大的价值。图 1. 单次单因子法 (OFAT) 和试验设计法(DoE) 的比较。 (A) OFAT 方法假设因子不相互作用并且最优条件是正交的，从而得到次优工艺条件。 (B) DoE 的统计框架考虑因子和正交性之间的相互作用，并更有效地探索实验设计空间，增强对过程的理解并增加找到稳健最佳条件的可能性。将 MANTIS® 与 Antha 相结合可简化 DoE在最近的一个案例研究中，Synthace Ltd 的研究人员将他们的 Antha 软件平台与来自Formulatrix 的高速自动化 MANTIS 液体处理器相结合，以执行复杂的多因子 (DoE) 培养基优化。本研究之所以选择使用 MANTIS 是因为其体积小——能够轻松装入生物安全柜——以及其大容量移液体积范围以及与筛选大量不同培养基组合所需的高容量 96 深孔板的先天兼容性。使用 eGFP 的生产作为一个生物产品的指标，在 3 次 DoE 迭代中选择了 12 个因子进行研究：胰蛋白胨 (2–12 g/L)酵母提取物 (5–25 g/L)葡萄糖 (0, 5 g/L)甘油 (0, 0.65% v/v) MgSO4 (0.2, 0.3 g/L)氯化钠 (0, 5 g/L)鼠李糖 (0.5, 3.0 mM)生长温度 (25, 37°C) 摇动速度 (80, 1000 rpm) 接种量 (15, 30 μL) 复制起点 (pBR322, pUC) 收获时间 (8, 24 hours)研究人员通过使用统计软件生成 DoE 设计文件开始研究，这些文件是精心构建的运行和条件列表，其中包含中心点、复制和对照以满足统计要求 。接下来，将设计文件上传到 Antha，其中还包含 DoE 自动化工作流程。该工作流程模拟了所有单独的液体处理步骤，因此降低了此类复杂实验的物理操作风险，如图2所示。在此之后，Antha 对 MANTIS 进行了编程，以执行 DoE 活动的第一次迭代的液体处理步骤。图 2. Antha 中液体处理步骤的可视化模拟。在初始筛选 DoE 中，使用了 825 个液体处理步骤来设置 96 个深孔板之一。左侧的“板”是 MANTIS® 试剂架的抽象表示。在右侧，可以在模拟中的任何点选择任何孔，以检查工作流程中添加的液体。总的来说，此处描述的 DoE 实验需要在 3 次 DoE 迭代中执行 1,298 次独特的实验运行：11 个因子用于初始筛选，4 个因子具有精细水平，3 个因子用于验证优化的介质和工艺条件。这分别相当于设置 13 个单独的 96 深孔板所需的 6660、1414 和 1717 个液体处理步骤。Antha 控制了所有规划步骤，通过实验设置示意图引导用户选择所需的库存浓度、体积和实验室器具（参见图2）。同时，MANTIS 在及时执行实验方面发挥了关键作用，仅使用11个芯片即可分配研究中涉及的全部液体试剂。统计软件与两个平台的集成提供了一个迭代设计/测试/分析循环，以极大地简化数据分析和模型改进，如图3所示。图 3. 迭代、自动化 DoE 的通用过程。 (A) Antha 软件平台将来自统计软件 (JMP®) 的输入转换为 MANTIS® 的液体处理说明文件。 Antha 然后汇集来自酶标仪的终点时间过程数据，并执行一套预处理步骤来清理数据集以进行即时分析，包括重复分组、空白校正、相对荧光单位 (RFU) 和光学映射 密度 (OD) 数据和基本统计数据，例如平均值、标准差和 CV。 (B) 更详细地说，包括 0 、2、 、6、8 和 24 小时的过程读数、空白、对照和细胞密度读数的 100 多个单独的读板机数据文件与 Antha 的执行运行信息相匹配，以生成 以流线型和自动化的方式校正细胞密度和相对荧光信号。在短短 3 周内提高产量使用 Antha 软件平台和 MANTIS 液体处理器联合执行复杂的多因子培养基优化，研究人员证明，在 3 周内仅执行 3 次 DoE 迭代，eGFP 产量就比对照增加了 5 倍（见图 4）。这一成功的基础是两个平台的易使用、具有成本效益和集成设置，可以快速确定影响生物指标 eGFP 生产的因子。图4. 优化 12 种生长培养基因子，使 eGFP 产量在 3 周内平均增加 5 倍。定制筛选设计用于生成第一次迭代(DoE 1) 中 11 个因子对 eGFP 生产的贡献的统计概况。从 DoE 1 中确定了促成最高 eGFP 产量的关键因子，然后在第二次迭代 (DoE 2) 中进行了调整：酵母提取物和鼠李糖的接种量和浓度。 DoE 2 中的收获时间也有所不同，以探索更具经济效益的 8 小时培养是否足够。所有其他因子保持不变。 DoE 2 具有使总 eGFP 产量平均比 LB 生长培养基对照增加 2 倍的效果。第三次也是最后一次迭代 (DoE 3) 侧重于关键工艺参数：鼠李糖和葡萄糖的浓度以及多个收获点的摇动速度。总体而言，结果表明，与 LB 对照相比，eGFP 产量增加了 5 倍。与其他 DoE 方法相比可节省大量时间除了将 eGFP产量提高 5 倍之外，将 Antha 软件平台与 MANTIS 液体处理器一起使用还可以显著节省时间。与其他方法相比，例如将 Antha 与另一个移液机器人一起使用或在没有 Antha 的情况下使用 MANTIS 液体处理器，将 Antha 与 MANTIS 液体处理器组合使用以计划、执行和汇总3次 DoE 迭代的数据可节省74%的时间。（参见图 5）。因此，用户可以更专注于设计和对实验进行说明。图5.与其他方法相比，Antha和MANTIS®可节省时间。将MANTIS®液体处理器和Antha软件平台结合起来，计划、执行和汇总3次DoE迭代的数据，与在使用Antha的前提下使用另一台液体处理器的或在不使用Antha的前提下使用MANTIS®相比，在96个深孔板中进行96次运行筛选DoE，可节省高达74%的时间。（预计时间基于Antha的人工实施和模拟的内部经验）。总结DoE在生物过程优化领域获得了广泛的关注，与OFAT方法相比具有明显的优势。然而，DoE的实施带来了一些挑战，我们认为通过结合Antha软件平台和MANTIS液体处理器可以显著减少这些挑战，如本研究所示。这种组合简化了DoE计划和执行，从根本上减少了所有流程优化组中DoE实施的障碍。现在，结合使用Antha和MANTIS简化DoE的计划和执行，减少了这些障碍。 通过调整本案例研究中描述的通用过程，从事生物制剂发现和上游过程开发的科学家可以使用DoE统计框架对其过程进行更科学的理解：错误更少，数据处理更精简，动手时间更少，以及更快地获得科学论断。

介绍免疫测定法的开发非常具有挑战性，这是因为获得特定信号需要正确组合样品和检测底物。多年来，Cisbio 开发了数百种测定方法。在本应用说明中，我们将展示 MANTIS® 液体处理器及其大容量芯片更换器 (LC3) 配件如何帮助我们在以下所有关键点上改进我们的工艺：可重复性、时间、成本和减少操作者肌肉骨骼疾病。在这里，我们将重点介绍两种类型的均相时间分辨荧光 (HTRF)®检测分析：生物标志物和磷蛋白分析。 HTRF 将 TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）的荧光灵敏度、时间分辨率和低背景特性与 FRET（荧光共振能量转移）的同质性结合在一起。图 1. MANTIS 液体处理器 和 LC3背景知识HTRF 使用两个荧光团，一个能量供体和一个能量受体，它们在彼此靠近时转移能量。这创建了一种同质的测定形式，其中结合和未结合的分子不需要分开，因为来自受体的荧光发射仅在分子结合时产生。每种测定都使用夹心形式，其中两种抗体用HTRF专用荧光团标记。生物标志物检测使用两种对目标蛋白质具有特异性的抗体（参见图 2A），而磷蛋白分为两种测定方法（参见图2B）。其中第一个测定方法是磷酸化试剂盒，在试剂盒中一种抗体靶向磷酸化位点，而另一种抗体靶向整个蛋白质。图 2A. 生物标志物测定的测定形式图 2B. 磷酸化和总测定的测定形式磷蛋白测定中的第二个测定方法是总测定试剂盒，它使用两种抗体靶向目标蛋白上的两个独立表位。为了获得一对功能正常的抗体配对，我们通常筛选 10 种抗体用于生物标志物测定。每种抗体都用荧光团、穴状化合物和d2标记。HTRF 供体荧光团穴状化合物由稀土配合物组成，其中嵌入了镧系离子，如铕或铽，并产生 1 至 2 毫秒范围内的长寿命发射，这是时间分辨检测的基本特征。d2 HTRF 受体由于其小尺寸和设计，在免疫竞争性测定中具有更高的稳定性，并且在某些情况下会提高测定灵敏度。对于磷酸化蛋白分析，我们测试了五种磷酸化抗体和五种总抗体。为了测试这些抗体配对，我们使用重组蛋白作为生物标志物，使用细胞裂解物作为磷酸化蛋白。这些样品中的每一个都被稀释两次以评估动态范围。这些稀释会在最终用户实施的培养基中进行（例如，用于分泌生物标志物的培养基，或用于细胞内磷酸蛋白的裂解缓冲液）。由于HTRF使用同质形式的一步检测实验方案，因此缓冲区组成可能对信号产生巨大影响。因此，我们开发了 4 种裂解缓冲液来匹配任何抗体对去污剂的敏感性。讨论在使用MANTIS之前，我们使用 384 孔板，一式三份。所有这些孔板加起来，其中1080 个孔将留给生物标志物试剂盒 ，3360 个孔留给为磷酸化/总筛选。3 到 9 号之间的微孔板编号 (见图3)。图 3. 生物标志物和磷/总测定的抗体配对匹配此实验设计不可能在一次操作中完成，而且最多需要 3 天才能进行一次筛选。因为多通道移液器不适合我们的操作，所以我们使用重复液体分配器完成这些操作，比如Eppendorf的Multipette。2 µL 精确分液的精度太低，板孔之间的交叉污染过多。因此，对于单块384 孔板，需要混合三种试剂，每块板总共有 1152 次移液动作。一年后，操作者的肌肉骨骼疾病成为了我们实验室的一个真正需要正视的问题。由于 MANTIS 能够分配到 1536 孔板形式中，因此我们能够按比例缩小 1536 孔尺寸的测定体积。我们能够将体积从 16 µL 样品和 2 µL 每种抗体减少到 4 µL 样品和 0.5 µL 每种抗体，而不会造成任何损失。此外，由于MANTIS 分配 5 µL 比分配 4 µL 更快，我们选择了它来完成我们的实验方案。(见 图 4)图 4. HTRF测定在信号和变异系数方面的比例缩小所以，我们准备好了。使用 1536 孔板，一次完整的筛选只需要 1 到 3块微孔板，每块板只需大约 30 分钟即可完成分配。这个时间还包含了自动芯片清洗时间，在这段时间内用户可以自由地做其他事情。显示实验设置的磷蛋白测定示例和结果如下所示 (见 图 5)。图 5. 磷/总测定的最佳抗体配对结果示例总结在一年多的工作里我们对这些改进进行了总结，这些总结包含了针对每种类型的至少十个项目，我们在许多层面上节省了时间、金钱和大量的劳动。 在使用MANTIS 之前，这些项目消耗了 130块384 孔板。通过改用 1536 孔板，我们成功将消耗的板数量减少 75%。(见 图 6A)。这一数量的板转为总共分配的44400个板孔。 每个板孔需要三次分液，总共13.32万次，这些全部由MANTIS操作完成，而非人工操作(见 图 6B)。图 6. (A) 超过 20 个项目所使用的微孔版数量。 (B) 手动分配微孔板的数量。 (C) 所用消耗品的成本。(D) 使用的抗体量。 (E) 最佳抗体配对筛选所用的时间。由于 MANTIS 芯片被设计成能够清洁和使用多达 100 万次分液循环，因此我们不必再担心耗材成本 (见图6C)。以前我们使用非常昂贵的重复分液器吸头，但是，当使用 MANTIS时，我们只需要一个标准吸头来处理在使用时添加到芯片中的每种试剂。我们还减少了试剂浪费，因为通常试管中的死体积可达 200 µL，但使用MANTIS，其死体积仅有 20 µL。再加上通过将 HTRF 试剂体积除以四来缩小我们的测定规模，我们节省了超过 1500 µg 的标记抗体 (见图 6D)。 还通过在一次操作中进行全面筛选，我们估计节省了 25 天的手动工作量，这样就不必拆分操作以便由研究人员手动执行(见图6E)。手动分配需要许多控制和校正步骤，而 MANTIS 提高了可靠性，且将误差降至最低。总之，MANTIS 正在成为我们实验室真正的游戏规则改变者。液体处理器使我们能够在各个方面改进我们的流程，考虑到一些我们熟知的不可能手动执行的操作，MANTIS会帮助到我们开辟新的可能性。

高效的高通量筛选是一个包含样品、化学、自动化和数据分析的复杂系统。传统的高通量系统利用6至1536孔板来支持产生可靠且具有统计学意义研究所需的大量实验条件。当前的技术需要大量投资在样品和试剂上，并且根据正在研究的细胞类型，其应用也会受到限制。例如，多步骤处理（例如多次洗涤）的研究通常需要贴壁细胞，而悬浮细胞非常适合不需要洗涤（例如添加、混合、读取）的均质测定。在这里，我们展示了一个独特的系统，该系统将 Curiox Biosystems 的 DropArray™ 板与 Formulatrix Tempest 的非接触式、低容量自动液体分配相结合，用于自动处理贴壁细胞和悬浮细胞。关于CURIOX BIOSYSTEMS DROPARRAY™ 微孔板DropArray™微孔板通过利用板平面表面的疏水性和亲水性特性实现“无壁”液滴分离。以网格图案排列在疏水基底上的亲水岛使分配的液滴“聚集”并保持样品之间的分离。将液滴分配到特殊涂层的表面后，将不混溶的液体盖密封液添加到板中，以防止交叉污染和液体蒸发。有关详细信息，请参阅 http://www.curiox.com/products.html。关于 FORMULATRIX TEMPESTFormulatrix Tempest是一款基于专有模块化微流控芯片技术的非接触式批量试剂分配器。它可配置为通过96个单独控制的通道同时输送多达12种成分的任何体积。DropArray技术得益于Tempest液体分配器的X-Y空间精度和精确的非接触式分配功能。 Tempest获得专利的微流体阀组使用正排量将离散体积的液体分配到96、384或1536孔板，且其不可回收死体积低至50µL。可选的堆叠器和条形码阅读器为仪器增加了额外的灵活性。FORMULATRIXTEMPEST方法和材料I. 细胞系和试剂COS-7 (非洲绿猴成纤维细胞样肾细胞) 和人类前列腺上皮 (hPRE) 细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并根据 ATCC 建议进行培养。通过使用CD8+ T 细胞分离试剂盒 (130-094-156; Miltenyi Biotec) 从随机健康供体的外周血中分离出人外周血单个核细胞 (PBMC) ，再从中纯化细胞毒性 T (CD8+ T) 细胞。使用的抗体和染色剂如下：单克隆抗体 APC 小鼠抗人CD8（555369；BD Biosciences）、Hoechst 33342 核酸染色剂（H-3570；Molecular Probes）、鬼笔环肽-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯（P1951；Sigma-Aldrich） )、ZO-1 兔多克隆抗体 (61-7300;  Invitrogen) 和 Alexa Fluor ® 488 标记的羊抗人 IgG (H+L) 抗体(A-11013; Invitrogen)。 抗 CD3/CD19 双特异性抗体产生于中国仓鼠卵巢细胞，并如前所述从细胞培养上清液中纯化 (1)。内吞抑制剂 Dynasore 水合物 (D7693; SigmaAldrich) 用于实时成像应用。使用了以下细胞活性测定试剂：CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (G7570; Promega)、CellTracker™ Green CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetate) (C7025; CMFDA; Molecular Probes)、溴化乙锭溶液 (EB; E1510; Sigma-Aldrich）、吖啶橙盐酸盐水合物荧光染料（AO；318337；Sigma-Aldrich）和碘化丙啶复染剂（PI；P3566；Molecular Probes）。II. 细胞转染按照制造商的标准方案，通过使用FuGENE®6转染试剂（E2691；Promega）以6µL的体积：在 OPTIMEM（31985-070；Invitrogen）中稀释的(1µgDNA，用互补DNA（cDNA）转染COS-7细胞。细胞在染色前培养48小时。III. 细胞活性测定在进行特异性细胞活力测定之前，用不同浓度的单甲基 auristatin E (MMAE)（一种合成抗肿瘤剂）处理细胞 72 小时。对于 CellTiter-Glo® 测定，将 2 µL CellTiter-Glo® 液滴添加到 DropArray™ 板上的 2 µL 细胞液滴中。在室温下培养 5 分钟后，在 EnVision 2102 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) 上读取板。对于基于荧光的分析，细胞用添加了 MMAE 的CellTracker™ Green CMFDA 进行标记。洗涤液滴以去除死细胞和细胞碎片，然后用 IN CELL Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences) 对板进行成像并使用 IN CELL Developer Toolbox v1.9 图像分析软件进行分析。IV. 免疫荧光染色细胞用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，用 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤，然后用 PBS/1% 牛血清白蛋白(BSA) 封闭 30 分钟。将细胞与 Fc 标记的诱饵蛋白或人特异性抗体在 PBS/1% BSA 中培养 1 小时，用 1X PBS 洗涤并与适当的荧光标记的二抗在室温下培养 45 分钟，然后用 1X PBS 洗涤 并成像。V. 自动化设备除了 Curiox Biosystems 洗板机之外，用于处理 Curiox Biosystems DropArray™ 板的完整自动化系统还包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis 和 Peak Analysis & Automation KiNEDx 机器人的 Overlord3 调度软件。该系统通过各种免疫化学、转染和细胞活性测定来处理贴壁和悬浮细胞，减少反应体积，同时产生可靠的数据。结果传统384孔板 vs. DropArray™ 板DropArray™ 无壁孔板可实现 在384 孔板上的小体积贴壁和悬浮细胞培养。覆盖 2 µL 细胞培养基液滴的培养油可避免蒸发并实现长期细胞培养条件（图 1）。使用 DropArray™ 技术对悬浮细胞和贴壁细胞进行细胞活性测定 使用 Tempest 和 DropArray™ 技术测试了几种细胞活性测定。使用标准 384-ul 板将反应体积减少到总共 4 µL（2 µL 细胞和 2 µL CellTiter-Glo®），而不是40 µl（20 µL 细胞和 20 µL CellTiter-Glo®），与使用CellTracker™ Green CMFDA 进行荧光活细胞染色相比，得出的半最大抑制浓度 (IC50)（图 2）非常接近。这些结果表明，与需要较大体积试剂的传统微孔板式方法相比，低体积的培养和测定条件产生了类似的结果。图 2. 洗涤细胞（荧光检测）和不洗涤细胞（发光检测）产生类似的 IC50 曲线。使用 DropArray™ VS微量滴定板进行细胞-表面蛋白质-蛋白质相互作用研究DropArray™ 板在基于细胞的多步骤测定程序中的性能通过表达克隆实验进行分析，以研究 IgLON 家族成员的蛋白质-蛋白质相互作用。使用优化的洗涤条件 (2)，DropArray™ 技术与使用常规自动洗涤程序的传统 384 孔板进行了比较。用边缘系统相关膜蛋白(LSAMP) 瞬时转染 COS-7 细胞（贴壁）、人胚肾 293T (HEK-293T) 细胞（半贴壁）和HEK-293S 细胞（悬浮适应）， 人类神经营养因子 (hNT) 或阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子样 (OPCML) 构建体。然后将表达 LSAMP、hNT 或 OPCML 的细胞与诱饵蛋白一起培养。使用 Alexa Fluor ® 488 标记的羊抗人IgG (H+L) 抗体检测 NEGR1-hFc 结合。与任一板格式的非转染细胞中的非特异性结合相比，观察到响应于 NEGR1-hFc 与 LSAMP、hNT 或 OPCML 的特异性结合，平均强度增加了 5 倍（图 3B）。图 3. 基于细胞的细胞外蛋白质-蛋白质相互作用。(A) 用 hNT 或 OPCML 表达构建体转染的 COS-7 细胞被固定并与 NEGR1-hFc 诱饵蛋白一起培养。用抗人 AF488（绿色）洗涤和染色细胞，并用 IN Cell Analyzer 2000 扫描。在标准 384 孔微量滴定板和DropArray™ 板中使用相同的试剂进行转染和染色，以进行直接比较。通过使用核的赫斯特染色（蓝色）在两种板格式中测量相似的细胞密度。比例尺 = 70 µm。 (B) 量化了采集图像中绿色通道的平均强度。当 NEGR1-hFc 与表达 NEGR1 结合配偶体的三种不同表达构建体的三种不同细胞类型结合时，观察到类似的强度值。以标准 384 孔板形式培养的贴壁细胞系 (COS7) 产生了类似的值，但在标准 384 孔板形式的洗涤过程中去除了弱贴壁 (293T) 和悬浮适应 (293S) 细胞系。在 384 孔板中未检测到 NEGR1-Fc 与 LSAMP、hNT 或 OPCML 转染的HEK293T或 S 细胞的结合，因为这些半贴壁和悬浮适应细胞在洗涤过程中被去除（图 3B）。然而，使用 DropArray™ 板和优化的洗涤条件处理细胞导致 NEGR1-Fc 与LSAMP、HNThNT 或 OPCML 转染的 HEK-293T 或HEK-293S 细胞结合，类似于 COS-7 细胞。384 孔板与 DropArray™ 板每运行 40 次的体积差异DropArray™ 板和 Tempest 液体分配器系统使转染实验中使用的大多数试剂减少了 10 倍（表 1），从而显着减少了试剂体积并显着节省了每个样品的成本。每个样本的成本降低使得完成检测的成本更低，并根据给定研究的总成本增加了可访问性。表 1. DropArray™/Tempest 系统减少了试剂的使用量。将DropArray™ 板与 Tempest 液体分配器结合使用，可将所需的转染试剂减少 90%。总结高通量筛选的挑战是以最少的成本和精力有效地收集足够的可靠数据。在这里，我们提出了新的仪器和实验室用具，这些仪器和用具减少了处理贴壁和非贴壁培养细胞的同质化测定、免疫荧光测定和转染的成本和工作。利用Formulatrix Tempest和Curiox Biosystems的DropArray™板收集的数据与使用标准384孔板获得的类似数据相比更有优势，但却节省了大量的试剂，因此也节省了成本。集成自动化平台包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis和PAA KiNEDx机器人的Overlord3调度软件。这个平台提供了一个强大而可靠的系统，可以对贴壁、半贴壁和悬浮细胞进行基于细胞的测定，大幅减少试剂，同时保有传统高通量筛选板格式获得的结果质量。

类器官使研究人员能够以非凡的保真度研究组织生物学。通过使用3D体外培养系统显示特定器官关键特征，这些复杂的多细胞结构给予了我们与生理相关的见解，帮助推动了许多研究领域。传统类器官培养的一个主要限制是它通常是一个劳动密集型、高接触的过程，需要高度专业化的人员来实现中等通量。麻省理工学院 (MIT) Shalek 实验室的研究人员使用 FORMULATRIX公司 的 MANTIS® 液体处理器，能够快速筛选超过 450 种不同剂量的小分子，以了解它们增强小肠类器官内潘氏细胞分化的能力。MANTIS® 提供了之前无法实现的通量水平，对于推进对有限样品材料的多重变化的理解至关重要。肠上皮屏障是重要的治疗靶点由皮肤、气道和肠道细胞形成的组织屏障提供与环境的相互作用和保护。它们起到平衡体液、营养、电解质和代谢废物水平的作用，与免疫系统密切合作，提供对病原体的防御，并在肿瘤监测和根除中发挥重要作用。 组织屏障功能障碍与广泛的疾病状态有关，比如感染、癌症、过敏和各种自身免疫性疾病。尽管可以通过抗病毒药物和抗生素等疗法来减轻环境暴露，而且还可以使用疫苗和免疫疗法改变免疫反应，但在某些情况下，靠现有方法并不能解决问题。 尽管是组织屏障的关键组成部分，但迄今为止，肠上皮屏障作为治疗靶点尚未得到充分利用。使用类器官系统对不同来源的肠上皮屏障组织进行建模，研究人员可以更好地了解这些复杂的系统，从而开发出治疗多种疾病的疗法。类器官模型正在推动研究进展类器官代表了近年来干细胞研究中最有价值的进展之一。源自单个成体干细胞、包含成体干细胞的组织样本或通过多能干细胞的定向分化，类器官包含能够分化为器官特异性细胞类型的干细胞群。这些细胞表现出与所代表器官相似的空间组织和功能，产生模拟体内条件的生理相关系统。图 1. 类器官表现出与代表器官相似的空间组织和功能，例如这种小肠类器官的隐窝/绒毛形态。类器官研究受到通量的限制有多种方法可以培养类器官。这些方法包括在存在成纤维细胞饲养层的情况下或在受控生物材料基质的表面上培养干细胞，但最流行的方法是将干细胞封装在生物衍生的细胞外基质 (ECM) 中，例如 Matrigel®。通过用含有特定生长因子的细胞培养基包裹平板接种的 Matrigel® dome，细胞随后增殖形成代表研究者感兴趣器官的三维结构。图2. Matrigel® dome 包裹干细胞，促进它们增殖以形成与生理相关的三维结构。Matrigel® dome上进行类器官平板接种有三个特定要求：1) 将载有细胞的 ECM 精确沉积到预热的组织培养板上，避免孔的边缘以保持最大生长所必需的dome形状； 2) 以非常小的体积进行精确操作，因为样品材料通常非常有限； 3) 合理程度的温度控制，因为 Matrigel® 和类似基材在 4℃ 时以粘性液体形式存在，需要温暖的表面和环境才能形成固化的水凝胶。由于这些要求，将类器官培养物小型化以达到与传统筛选设备（96/384/1536孔格式）兼容的规模是极具挑战性的。虽然，相当琐碎且耗时的Matrigel® 沉积过程可以在 48 孔板上通过手动完成，但是在更大的孔板容量时液滴错误形成率会显著上升，并极大地限制了实验的可重现性。MANTIS® 是一种用于小型化类器官研究的实验台大小的解决方案为了克服手动 Matrigel® 沉积方法的局限性，麻省理工学院 Shalek 实验室的研究人员使用 FORMULATRIX 的 MANTIS® 液体处理器将 Matrigel® 液滴分配到各种板格式（最多 384 孔）中。本研究的目的是在适合高通量方法的规模下使用小肠类器官系统完成化合物筛选活动。 MANTIS®使用单通道非接触式微流控分配器一次输送单个试剂至单个孔中，将液体限制在一次性芯片内，以防止交叉污染，且无需清洗。行业领先的小于3%的CV支持着低至0.1µL的精确体积输送，同时通过容纳6-48个芯片和处理高达25 cP的水溶液（相当于室温下约60%的甘油）实现了多个工作流程的灵活性。除了这些功能外，MANTIS占地面积很小，仅1ft3，这意味着它可以轻松地安装在冰箱或培养箱等温度控制环境中。它还与广泛的实验室软件和仪器兼容，能够无缝集成到现有的工作流程中。图3. MANTIS® 的占地面积非常小，可以在温度受控的环境中进行密封。在本次试验中将MANTIS® 放置于冰箱内，使得在 4℃下将 Matrigel® 平板接种到加热表面（灰色 =冷，红色 = 暖）。这些是形成 Matrigel® dome的理想条件。小肠类器官培养的小型化给予了关键见解麻省理工学院 Shalek 实验室的博士后 Ben Mead 及其同事使用 MANTIS® 使现有工作流程小型化，并在小肠类器官系统中筛选了一个化合物库，以识别可能增强潘氏细胞分化的工具分子。这些是人类小肠的主要抗微生物生产细胞，对上皮屏障功能至关重要。在应用稳健的统计测量数据（尚未发布）之后，Mead 及其同事确定了许多苗头化合物。其中一些已进入后续研究，为描绘新的生物靶标供潘氏细胞定向分化考虑提供了重要机会。规模扩大增加了个性化医疗的机会MANTIS® 的几个关键特性是麻省理工学院研究人员发现的基础。通过使用单个自由臂分配 Matrigel® 液滴，MANTIS® 可在各种板格式（最多 384 孔）中提供精确平板接种，以增加实验规模。该仪器还能容纳 1536 孔板，可根据需要进一步扩展通量。可清洗的一次性芯片连接移液器吸头，让麻省理工学院的研究人员能够处理有限的样本量，同时降低试剂需求和相关成本。此外，MANTIS® 的占地面积小意味着整个装置可以轻松安装在标准冰箱中，并与预热块结合，以将冷却的 Matrigel® 液滴准确地沉积在预热的组织培养表面上（见图 4 ); 与手动技术相比，这种平板接种得到显著改进。图 4. MANTIS® 显着降低了试剂需求，包括每孔 Matrigel® 体积、平板接种培养基体积和肠道类器官接种数量，同时还能缩短平板接种时间。麻省理工学院的研究人员已经证实，MANTIS®所提供的微型化方法在研究有限材料的多重变化方面是有效的。这与检测来自单个患者活组织检查的类器官相关，并为个性化医疗开辟了许多新机会。随着技术的发展，加入其他测量模式将进一步提高模型保真度。MANTIS®是实现更大规模需求的关键。

介绍: 自1960年代可变体积移液器问世以来，研究人员一直在牺牲其液体转移的精度，以换取其易用性、效率和速度。然而，基因组学实验室中减少反应体积的新趋势对各种液体处理解决方案的效能提出了质疑，特别是因为较低的反应体积往往会增加不精确液体处理对实验结果的影响。由于精准医学和药物发现严重地依赖于学术界和生物技术领域的转化基因组学实验室发表的研究结果，因此数据的可重现性变得格外重要且需受到高度审查。今天，研究人员普遍认为自动化工作站是最具重现性的液体处理解决方案，因为自动液体处理 (ALH) 系统消除了许多与用户可变性相关的障碍。研究人员主要通过测量液体转移的不精确性来评估这些设备的移液体积性能，通过变异系数 (CVs) 定量表示。 ALH 平台的分液一般来说非常精确，而且对于数十至数百微升 (µL) 范围内的目标液体分液的 CVs 往往小于 1%。但是，对于大多数 ALH 系统，随着目标液体体积接近 1 µL，规格也会不尽如意。事实上，最广泛使用的液体处理平台发布的包括CVs在内的规格在 0.5 µL 时达到了6% 之高（表 1）。表 1: 与 ISO 8655 手动移液器的最大允许误差相比，已公布的两种常见 ALH 系统（10 µL 的一次性吸头）的CV。FORMULATRIX® 和 Artel 推出此应用说明是为了展示 MANTIS®液体处理器的精度，MANTIS是一种旨在作为传统液体处理平台补充的新型解决方案。通过操作MANTIS，研究人员可以提高那些涉及以高精度分配少量有价值试剂的基因组学工作流程中的实验可重现性。MANTIS的核心是一个获得专利的微流体阀组，用于测量和分配离散体积的液体（图1）。压力和真空打开和关闭硅胶阀组上的每个阀门。容积式芯片有两个微型隔膜，可以以每秒 10 次的速度填液和分液。低容量 (LV) 芯片包含 0.1 和 0.5 µL 隔膜，而高容量(HV) 芯片包含 1 和 5 µL 隔膜。 持续流 (CF) 芯片采用独特的基于阀门的技术，允许在持续流中分配从 5 µL 到 2000 µL 的体积。图 1: FORMULATRIX® 获得专利的微流体分液技术材料: Artel ELx800 NB 读板机 (图 2)Artel MVS 校准板 (图 2)Artel 样品溶液 (图 2)21x Artel 384 孔验证板12x Artel 96孔验证板图 2: Artel 多通道验证系统 (MVS)Q-Instruments Bioshake 3000 (图 2)Grant-bio LMC-3000 实验室离心机HONEYWELL Xenon 1902 条码读取器 (图 2)FORMULATRIX MANTIS 液体处理器 (图 3)图 3: FORMULATRIX® MANTIS® 液体处理器方法: 在这个实验中，MANTIS液体处理器将目标体积的Artel样品溶液输送到精心表征过的Artel 96或384孔验证板的每个孔中。离心和混合后，Artel MVS读取样品溶液的浓度，并通过Artel MVS软件的图形用户界面得出每个微孔板的CV值。为每个96孔或384孔微孔板选择一个离散的目标体积，以保证所输送的一组样品液体令人信服。在三种微流控MANTIS芯片类型中选择了11个目标体积，以便对与MANTIS相关的液体处理不精确性进行全面审查。根据以往最佳的实验经验，每个目标体积的每次操作都进行了一式三份的测试，以确保实验结果具有统计学意义。使用 HV 和 LV 芯片类型进行的所有体积测试均使用 Artel 384 孔验证板。使用 CF 芯片类型进行的所有测试均使用 Artel 96 孔验证板。低密度板用于所有 CF 测试以适应200 µL 分配体积并确保该芯片类型所有测试的一致性。结果: 如公式 (1) 所示，通过在重复性条件下计算 一系列 96 或 384 测量体积的标准偏差来评估每次操作的随机误差。whereSr(l,m) - 是运行“m”期间通道“l”的随机误差V(l,m,n) - 是单个测量体积V(l,m) - 是运行“m”期间通道“l”的所有测量体积的平均值N - 是运行中的复制移液数量该标准偏差用于计算以百分比表示的变异系数，如公式（2）所示。whereCv(l,m) - 是运行“m”期间通道“l”的变异系数 使用均方根方法对每个目标体积的三个单独运行的 CV 进行平均，如下面的公式 (3) 所示。选择这个公式是因为每次运行的重复移液数量是一致的。whereCv(l) - 是通道“l”的变异系数，它结合了多次运行的数据M - 是包含在平均值中的运行次数2 在整个体积范围内，所有 CV 和 CV 的均方根 (RMS) 均小于或等于 1.5%（表 2，图 4）。表 2: FORMULATRIX® MANTIS®液体处理器测试结果。总结: 基因组学实验室之间实验的可重复性在很大程度上会受到移液的不精确性的影响，尤其是在低纳升级体积的情况下。本应用说明中发布的数据证明，即使体积低至 0.1 µL，MANTIS 的 CVs 也还是远低于 2%，这为研究人员提供了一种解决方案，有助于在等高度敏感的方法（例如下一代测序 (NGS) 和 qPCR）等中生成值得信赖的结果。随着越来越多的研究人员在他们的基因组学工作流程中使用低于 10 µL 的反应体积，确保在这些体积范围内进行高精度液体处理将变得比以往任何时候都更加重要。MANTIS可以轻松搭配任何传统的液体处理工作站，以便在整个移液范围内获得低于2%的 CVs。图 4: 目标体积为1µL（HV芯片CV（1,3））的单次运行的分配体积测量

介绍: 产业界与学术界的合作使更有针对性和成本效益的药物发现方法成为可能。通过这种高度的合作，全世界的学术机构已经可以访问包含数十万化合物的化合物库。有限的预算和高度可变的项目使人们更加需要具有成本效益和易于使用的工具，以促进高效的测定开发和筛选。此外，由于这些项目需要按照工业标准运行，因此高通量筛选的自动化需要具有可重复性，以保持这种药物发现过程的可行性。本应用说明重点介绍了 TEMPEST® 的使用方法，它是一种多功能微流体试剂分液器，旨在以小型化分析体积执行测定开发和高通量筛选，将测定试剂的成本降低 60%，同时生成高质量的筛选数据。 UCL的药物发现小组证明，当使用 TEMPEST 液体处理器进行自动化处理时，只需 1.6 µL 的总反应体积即可测定 12000 条hit确证量效关系曲线，与过去的液体处理方法相比，检测试剂的成本降低了 26000 英镑 。材料: • Labcyte Echo 液体处理器• FORMULATRIX® TEMPEST® 液体处理器• Hidex Sense 读板机• 375x 384孔板图 1. FORMUATRIX® TEMPEST® 液体处理器方法: 使用 TEMPEST® 液体处理器，反应体积从 4 µl 缩小到 1.6 µl。这意味着所需的检测试剂体积从 12 µl 减少到 4.8 µl，但是误差没有增加，检测窗口也没有减少。使用激活肽的量效关系曲线来确定测定的保真度。在 Hidex Sense 读板机上读取数据并使用 Graphpad Prism 和 Genedata Screener 进行分析。结果: 减少分配体积的主要目的是为了减少筛选的检测试剂成本。对于在量效关系曲线上12000个化合物的筛选，检测试剂的体积能够减少近1/3，意味着节省了26000英镑。预计检测保真度不会降低，而且，使用TEMPEST®液体处理器减少了检测中的误差，并将robust Z`从试点研究的0.3提高到375板筛选的0.66。图 2. 阳性对照化合物浓度反应总结: 学术与产业的合作使学者能够访问获得了大型化合物库，而这些化合物库需要成本效益高、易于使用的液体处理器来进行筛选。通过使用TEMPEST®液体处理器，我们将hit确证筛选的体积减少了1/3，从而为375板筛选节省了26000英镑。此外，筛查中的数据质量也得到了改善，通过筛查的robust Z`为0.66。最后，该系统的易用性使其成为多用户实验室和对自动化液体处理解决方案经验有限的科学家的理想选择。

Biogazelle 是一家合同研究组织 (CRO)，专门从事支持药物研究、临床试验和诊断测试开发的高价值应用。为了加速包括小分子、RNA 靶向药物和过继细胞疗法在内的疗法开发，他们使用了一套基因组和转录组学技术。Biogazelle 在对液体活检和福尔马林固定石蜡包埋组织等珍贵临床样本应用定量 PCR、数字 PCR 和专用 RNA 测序工作流程方面处于独特的前沿地位。2020年4月，他们引入了高通量、模块化和可扩展的 SARS-CoV-2 RT-qPCR 检测平台，每天可处理多达 6000 个患者样本。诊断测试使用ISO17025 质量管理体系运行。除了外部“全过程”质量控制样品（即经历从样品初次转移到RNA提取到 RT-qPCR的整个工作流程的阳性和阴性样品），也使用了运用专有体外转录非人类 RNA的内部RNA spike-in 对照。该对照验证了提取正确的纯 RNA，不含RT-qPCR 抑制剂。将少量(4 μL) spike-in对照精确、准确地添加到每个患者的裂解液中。由于每天需要在数十个96孔板上进行此操作，因此自动化就显得尤为必要。图1: MANTIS® 液体处理器。Biogazelle 选择 FORMULATRIX® MANTIS® 液体处理器（图 1）作为其诊断 SARS-CoV-2 RT-qPCR 测试中的自动分液系统，是因为Mantis占地面积小、灵活和高速准确分液的特性。但是，在质量控制过程中引入和使用仪器之前，必须根据具有特定验收标准的预定义方案对仪器进行验证。Biogazelle 着手验证 MANTIS 是否满足两个关键要求：•  快速、准确和精确地分配小体积液体。•  在满足第一点的前提下，且不会在相邻孔中引入飞溅物，导致交叉污染。后一个标准在 SARS-CoV-2 病毒诊断中至关重要，因为患者样本可能含有每毫升超过 10 亿个病毒载量的运输介质。在这种情况下，即使是 10 皮升（喷墨打印机墨点的大小）的微小液滴仍 会含有 10 多个病毒载量，这足以产生假阳性结果。MANTIS取芯、充注、96孔分液、芯片重新定位和机械臂归位的时间不到 90 秒，其绝对符合速度标准。之后又使用两个功能性定量 PCR 测试验证了它的准确性和精密度。在第一次测试中，MANTIS 将 8 μL 高浓度DNA寡核苷酸标准溶液输送到 17 μL 预混液（包括引物和 PCR 混合物）中。然后使用校准的电子重复移液器手动分配到 96 孔板的每个孔中。在板密封、涡旋和离心之后，将 5 μL液体 一式四份转移到384 孔 qPCR 板的每个孔中。然后在 qPCR 机器上进行循环并导出数据（图 2）。图 2: 由 MANTIS® 制备的 4 x 96 反应的 Sigmoidal qPCR 扩增曲线。然后将数据导入到 Biogazelle 开发用于 qPCR 仪器功能验证的免费网络应用程序中，并略加改变以验证 MANTIS 的精度。Biogazelle博客上提供了有关 Web 应用程序的更多信息 。该软件的结果显示出MANTIS出色的精度，没有缺失值，384 个 Cq 值的标准偏差为 0.133，0.5 个循环内所有数据点的重复性为 99.5%（图 3）。图 3: 图 2 中的数据由 Biogazelle 的免费网络应用程序处理，在预定的验收标准内展示了出色的精度。在第二个测试中，在一块96 孔板中加入5 μL 人类基因组 DNA ，分为12个区间在11.54 到 60 ng/μL 之间的不同浓度（列），同等复制8份（行），然后用MANTIS 添加18.08 至 115 μL 范围体积的无核酸酶水对前者进行标准化处理。所得 DNA 源板含有 2.5 ng/μL 浓度的DNA，其中 2 μL一式四份添加到 384 孔板中的 5 μL SYBR Green I qPCR 中。使用上述网络应用程序分析了 qPCR 数据，证明了 MANTIS 完美的浓度标准化，反映在其出色的精密度和准确度上：没有丢失 qPCR 数据，所有 384 个 qPCR 数据点的标准偏差为 0.144，0.5 个循环内的所有数据点的重复性为 99% 。最后，为了评估MANTIS高速微滴分液不会引入可能导致交叉污染的气溶胶或飞溅物，进行了最终验证实验。在这次实验中，使用MANTIS将 4μL 的 RNA spike-in 分配到96 深孔微量滴定板中，板中装有 200 μL 无核酸酶水或每微升500 万病毒载量的 DNA 寡核苷酸溶液。图 4: 没有证据表明 MANTIS® 引入了交叉污染。使用 MANTIS® 处理的高浓度（500 万病毒载量/μL）源板中的2 μL 液体，得出的重复 qPCR 数据的384 孔板视图。空孔表示没有 qPCR 信号；其他孔显示观察到的 Cq 值。含有寡核苷酸溶液的 18 个孔以棋盘状模式定位，其中每个含有寡核苷酸的孔被 8 个不含标准分子的纯水孔包围。在 384 孔板中的 5 μL SYBR Green I 反应中，所有 96 孔中的 2 μL 溶液的qPCR读数一式两份（在所有交替行中具有额外的阴性对照反应），证实在与诊断工作流程非常相似的实验条件下使用MANTIS完全不会引起交叉污染（图 4）。基于这些验证实验，我们发现 MANTIS 适用于在 96 孔板中精确、准确和无交叉污染分配小固定体积液体，能够作为诊断 qPCR 工作流程的一部分。同时，通过分配足够体积的水以获得相似的最终浓度，MANTIS 被验证能用于标准化 96 孔板中的核酸样品或测序文库。FORMULATRIX 感谢 Biogazelle 团队分享他们的验证工作流程和数据。 Biogazelle 提供的网络研讨会可在 FORMULATRIX 网站上查看。

用户--Cisbio应用说明此展示材料分享了与 FORMULATRIX® 公司合作使用 MANTIS® 液体处理器开发用于检测乙型肝炎“e”抗原 (HBeAg) 重组蛋白的 HTRF® 检测方法。使用 MANTIS® 提高了工作流程的效率，能够分析更多条件，同时节省时间和试剂成本，而且还可以获得可重现、无错误的结果。与传统分液方法相比，MANTIS® 液体处理器使 Cisbio公司能够更快地完成所有检测开发步骤（即最佳配对分析、偶联物优化等）。MANTIS® 液体处理器可自动分配低至 100 nL 的微流体液体，从而实现高效且可重复的分析优化。MANTIS® 能够将不同微孔板中的小体积液体分配到任何反应孔中，这使研究人员能够根据任何 384 孔或 1536 孔微孔板中的浓度和体积梯度评估分析性能。再加上MANTIS小于 3% 的 CV 和 6 µL 的死体积，这些功能使 MANTIS® 成为快速有效地发现 HTRF® 检测最佳条件的理想解决方案。重组蛋白和最佳配对抗体的选择12 种市售抗体用 HTRF® 染料标记并偶联成 36 对配对抗体，以评估它们检测重组蛋白 HBeAg 的能力。对来自 2 个供应商的重组蛋白 (rProtein) 进行了 3 种不同浓度（500、50、5 ng/mL）的测试，以找到最适合我们检测的一种。来自供应商 1 的重组蛋白没有显示相关信号，因此在本研究的下一步中没有对其进行进一步研究。当使用供应商 2 的 重组蛋白 进行测试时，13 对配对抗体显示出明显的信号（图 1）。其中，前 4 对配对被选择用于下一个检测开发步骤 - 抗体配对优化（图2）。抗体配对优化MANTIS® 允许同时研究多种抗体，考虑到这一点，我们选择研究 12 对配对抗体。在这里，我们使用该系统在一个步骤中优化每个选定的配对。配对1+6、9+12、9+6 和 11+10 使用以下配置进行优化：抗体供体 (D) 和抗体受体 (A) 在矩阵方法中以 3 种不同浓度进行测试。重组蛋白浓度一开始为2000 ng/mL，然后进行 2 倍稀释。重组蛋白和抗体以 16:2:2 形式（16uL 重组蛋白，每种抗体 2uL）分配在白色小体积 384 孔板中。从选择的 4 个潜在配对中选出了 2 个最佳配对。这两对配对是动态范围（1+6；图 3.A）和灵敏度 （9+12；图 3.B）之间综合的最佳者。培养基的影响进行以下实验以评估细胞培养基对 2 对选定的配对抗体1+6 和 9+12 的影响。两对均以 500 ng/mL 的浓度开始进行测试，然后在稀释剂、RPMI 或 DMEM 中稀释2 倍。重组蛋白稀释液和抗体以 16:2:2 形式（16uL 裂解物，每种抗体 2uL）分配在白色小体积 384 孔板中。当在配对 1+6 的测定中使用 RPMI 时，观察结果显示培养基的影响甚微，而 使用DMEM时显示培养基的影响比较大。当细胞培养基用于配对 9+12 时，观察显示培养基影响很小。虽然这对配对表达的信号比较低，但它被选为检测乙型肝炎“e”抗原重组蛋白的最佳配对抗体，是因为它比配对 1+6 具有更好的灵敏度。检测重现性评估该检测的重现性并绘制标准曲线以研究其动态范围。对于该实验，在室温下将不同浓度的重组蛋白与抗体配对 9+12 一起过夜培养（图 5）。该测定显示出良好的重现性并表现出以下特性：动态范围：0.5 ng/mL 至 125 ng/mLLOQ* = 0.5 ng/mLLOD** = 0.193 ng/mL*LOQ：定量限（基于 20% DF 时的信号）**LOD：检测限（基于 30 次重复的 Std 0 均值 + 2 SD）总结事实证明，Formulatrix® 的 MANTIS® 液体处理器是一台高效的分液仪，它可以同时处理多个实验条件并快速开发和优化 HTRF® 分析。从大量选择项（2 种重组蛋白、36对配对抗体、2 种细胞培养基条件）中成功识别和优化了使用该分液仪得到的测定参数，而这些参数构成了灵敏且可重现的 HTRF® 检测。

介绍跨国生物技术公司 Life Technologies 为支持其 SelectScreen® 服务业务，研究并测试了各种自动化液体处理器，以简化向 Z´-LYTE® 384 孔板中添加三磷酸腺苷 (ATP) 的过程。经过严密的测试，FORMULATRIX公司的TEMPEST系统满足了 Life Technologies 对可靠性、准确性和精密度的所有严格要求。现在TEMPEST 系统已是 Life Technologies 工作流程中的日常伙伴。关于Life Technologies公司Life Technologies是一家生物技术背景的跨国公司，为不同的生命科学专业人士提供世界一流的产品和服务。其所提供的这些系统、耗材和服务帮助研究人员加快了科学探索，促进了研究发现和发展，改善世界各地人们的生活。Life Technologies的SelectScreen®服务（www.lifetechnologies.com/discoveryservices）为药物研发客户提供了高通量筛选和化合物分析服务。其生化和细胞检测形式的多样化组合可用于激酶、G蛋白偶联受体（GPCRs）、核受体、离子通道、P450s和基因KCNH2（hERG）筛选。有特殊需求的客户可以与SelectScreen®服务团队合作，进行定制化的测定开发和筛选。自2004年以来，他们已经完成了17000多个项目，其中超过99.5%的项目都按时交付。SelectScreen® 服务团队致力于在遵照客户时间计划表的同时提供高质量的筛查数据。为了满足这些要求，该团队在这些服务的各个方面都采用了严格的质量控制和自动化流程。在基于条形码特定工作列表的自动化处理过程中同时分配试剂时，团队所使用设备提供的高准确度、精密度以及灵活性至关重要。2012 年，SelectScreen® 团队着手购买一台新设备，以简化向 384 孔板添加 ATP 的流程。这一新仪器 需要满足以下严格要求：非接触式分配，样品之间没有残留。小体积分液，分液体积范围为2.4 μL 至 5.0 μL 。 高通量筛选，每小时能够处理 50多 个 384 孔板。能够将多达 11 种不同的试剂分配到特定/离散的微孔板位置。能够读取微孔板条码信息以检索微孔板特定的分配列表和做到适宜分配。为终端用户做到最大易用性。强大的仪器性能以及提供快速维护和维修服务。处理所有试剂的死体积都很低。基于这些要求，他们选择了来自 FORMULATRIX 公司的TEMPEST 液体处理系统并对其进行评估。关于TEMPESTFORMULATRIX公司的TEMPEST系统是一种基于专有模块化微流控芯片技术的非接触式散装试剂分液器。通过配置，它可以通过 96 个单独控制的通道同时输送多达12种不同液体的任何体积。TEMPEST获得专利的微流体阀组使用正排量技术将离散体积的液体分配到 96、384 或 1536 孔板中，每种液体的不可恢复死体积低至50µL。可选用的堆栈器和条形码阅读器为该仪器增加了灵活性。性能测试和结果在购买新设备并用于日常筛选活动之前，设备必须经过彻底的功能和非功能测试。以下是为评估FORMULATRIX公司的TEMPEST系统而进行的一些功能测试，以及最终决定购买该设备和后续日常使用该设备的测试结果。I. 准确度和精密度测试SelectScreen®实验室中使用的任何设备都必须具备非常高的重复性和再现性。该团队在分配 2.4uL 缓冲液时需要 95%以上的准确度，对所有安装的芯片分配 2.4 μL 缓冲液时需要 90%以上的准确度。在这些测试中，Life Technologies公司的1x 激酶缓冲液A与作为分配试剂的10nM的荧光素混合。用TEMPEST 系统将 2.4uL、 10nM的荧光素分配到微孔板上，并用 12.6uL 激酶缓冲液 A 手动回填。摇振微孔板，以 1000 RPM 离心一分钟，并培养一小时。通过重量分析确定准确度，使用Tecan Safire2™荧光读板机在 485/520 nm 激发/发射波长下确定精密度 (%CV) 。这些测试的结果完全在要求的值之内，如表 1 所示。II. 溶液残留测试为了保证分析的完整性，在分液时必须保证微孔板中残留最少的溶液或是无溶液残留。为了对此进行测试，使用 Labcyte Echo 声学分液器在奇数列中用 100% DMSO 中的20nL 、1mM 的荧光素填充两块测试板。然后使用TEMPEST 将激酶缓冲液 A 分配到所有孔中，包括空孔和含有荧光素的孔，最终分液体积为 15uL。TEMPEST 还向一块空的不添加缓冲液的微孔板中分配了 15uL 缓冲液。摇振所有微孔板，以1000 RPM 离心一分钟，然后培养一小时。在 Tecan Safire2™读板器上以 485/520 波长对所有微孔板进行读取，且所有微孔板都有固定增益。分析测试板上仅加缓冲液孔的荧光值并与不添加缓冲液的微孔板的荧光值进行对比。如表 2 所示，Blank Plate和Test Plate上的仅加缓冲液的孔具有可比的标准偏差、精度和荧光值 (RFU)。 此外，通过运行 12 点标准曲线来测试直接稀释分液，使用 TEMPEST 分配荧光素作为直接滴定，然后加入激酶缓冲液，最终体积为 15uL。在激酶缓冲液中，起始浓度为10uM的荧光素经过1.5 倍稀释。振摇微孔板，以1000 RPM 离心一分钟，然后培养一小时。在 Tecan Safire2™ 读板器上以 485/520 nm 激发/发射波长读取微孔板。 TEMPEST 能够实现 1.49 倍的平均稀释，或 99% 的准确滴定。III. 功能测试，ATP 分液为了在 TEMPEST 上测试 ATP 分液性能，将TEMPEST 与手动添加 ATP 进行并排比较。使用所有 11 种 ATP 试剂浓度进行了 20 次测定。使用自动分液获得的抑制百分比值优于手动添加获得的值，表明 TEMPEST 对于向 Z’LYTE® 检测板添加 ATP 的效果很好（图 1）。TEMPEST使用SelectScreen® 激酶分析团队经常使用 TEMPEST 将 ATP 分配到 Z´-LYTE® 检测板中。 Z´-LYTE®生化分析采用基于荧光的偶联酶形式，并基于磷酸化和非磷酸化肽对蛋白水解裂解的不同敏感性。 ATP 是该测定的能量来源，反应中 ATP 的量对激酶的“活性”或底物的磷酸化量有影响。SelectScreen® 生化分析服务为超过275 种激酶提供基于活性的检测，提供 10 µM ATP、100 µM ATP 和 Km 表观。这需要 11 种不同的 ATP 浓度范围从 5 µM 到 500 µM 的单独试剂溶液。该团队需要一台具有动态试剂选择的仪器，以便为根据提供的工作清单进行的每项检测采购合适的试剂。由于分配后的 ATP 浓度对测定完整性至关重要，因此输送 ATP 的方法必须非常精确和准确。由于每块检测板的板布局都是独一无二的，因此该步骤在自动化时效果最佳，以确保将正确的 ATP 试剂以高可信度输送到正确的孔中。在常规生产运行中，TEMPEST 读取检测板上的条形码，该条形码链接到一个文件，该文件列出了该特定板的源 ATP 试剂和目标孔。然后 TEMPEST 基本上同时将各种 ATP 试剂分配到正确的孔中。该仪器还提供微孔板分配和分配时间的审查跟踪。总结SelectScreen®服务的执行有着严格的质量控制和自动化流程，以确保每次都能提供可靠的数据。 TEMPEST 已达到 Life Technologies 在其服务中使用自动化所需的高标准，现在已成为其日常工作流程的一部分，该工作流程帮助提高了效率和增加了吞吐量，使Life Technologies 能够向其客户提供高质量的数据甚至缩短项目完成时间。

应用:GeneMark实验室是一个相对高通量的亲子鉴定实验室，位于新西兰汉密尔顿市。该实验室主要服务于该国国内牛乳制品行业，并提供对整批犊牛群中每一只与其单亲直至与双亲全部匹配的亲子鉴定服务。本地畜群规模平均略超过500只，最多可达数千只。在需求高峰期间，实验室每天的动物检测量超过了3000只，大多数样本使用Sequenom的iPLEX Platinum PCR chemistry和MassArray机器进行处理。前者是将PCR预混液添加到磁珠提取的DNA中，然后进行PCR循环。在该过程的不同时段，添加3次预混液，然后再进行PCR循环。第一次添加1.5微升预混液到384孔PCR板中1.0微升的DNA中。随后两次往DNA中分别添加1.0微升的预混液。TEMPEST®负责之后两次添加1.0微升的预混液添加剂。之前的方法:每天准确制备10个及以上384孔板并不是一件靠人工能轻松完成的事情，尤其是在PCR量较低的情况下。出于这个原因，实验室很早就从动微孔板板制备（使用单道和多道手持移液器）转向自动化制备。之前自动添加1.0微升液 体使用的是Innovadyne公司的NanodropII仪器。它是一种压电非接触式点样仪，专用于小容量（微升至亚微升）点样。用户反馈：Innovadyne的仪器在 384 孔板上分配这些体积的准确性和速度完全在我们要求的公差范围内，并且在购买时也是最符合我们的实验目的。但是，它需要一个8匹储液器或一个储液槽来为所有8个通道储液。即使使用小型 0.2ml PCR 管作为储液器，与分配的总体积相比，浪费的 PCR 液体的死体积也相当高。PCR预混液是该实验过程中最昂贵的材料，因此任何死体积浪费的减少都是一笔有价值的节约。TEMPEST液体处理器能够使用任一大小的外部储液器（如Eppendorf管或甚至是15-50ml 的Falcon管）并回收生产线内的所有PCR预混液以供重复使用。更重要的是，它能够使用单个移液器枪头作为所有 8 个通道的储液器。而且，此移液器枪头储液器通过微通道和TEMPEST仪器芯片中隔膜的液体路径也很短，这意味着实验过程中几乎没有液体浪费。因而这导致实验室里要为一系列微孔板准备的预混液量大幅减少，并且随着通量的持续增加，减少量也会越来越多。TEMPEST与被它所取代的Innovadyne的仪器相比，它是一台极其简单的机器。Innovadyne需要每天花费大量时间用氦气对系统液体进行脱气，而TEMPEST（使用固定体积的隔膜）可在启动时立即运行。隔膜的优点是不受液体粘度或环境温度和湿度的影响，这使得受这些因素影响很深的小体积液体也能精确控制这些因素。两个仪器平台都是非接触式分液器，能够非常快速地在384个孔中分配1.0微升的液体体积。TEMPEST 的编程非常简单，可以将液体分配到一些特定的反应孔中，而将未选中的孔留空，这对于后者仪器而言需要进行更多相关的编程操作才能实现。对于这两种仪器的权衡比较在于，TEMPEST分配的体积不太灵活，因为其必须根据每个芯片必须选择的隔膜尺寸来设计总输送量。然而，这对于我们正在处理的特定体积液体来说并不是一个重要因素，并且TEMPEST带来的时间和材料上的节省也让这一权衡比较有了偏向性。用户：GeneMark

介绍细胞系生成通常被认为是一个漫长而乏味的过程，需要大量的劳动力和材料投资。在细胞系开发中，尤其是在单克隆抗体和蛋白质治疗剂的生产中，需要具有高活性的单克隆性和稳健的克隆生长。自动细胞分配和细胞计数技术可提高通量，同时减少分配、识别和验证每孔单个细胞是否存在所需的时间和劳动力。本研究比较了使用自动Formulatrix Tempest液体分配器和Brooks Celigo®成像细胞仪与电动手动移液和手动分析将CHO细胞分配和分析到384孔板的情况。  方法和材料I. 细胞培养为了制备单细胞接种和克隆生长的细胞， CHO-K1YFP细胞在T-25c㎡的烧瓶中用含有10% FBS和1%G418的F-12K培养基进行贴壁培养。细胞在37℃和98%的相对湿度下，置于5%的二氧化碳中培养。为了进行活性研究，将悬浮的CHO（CHOs）细胞培养在125mL的锥形瓶（Corning #430421）中，其中含有30mL CD CHO培养基（Gibco #10743），还添加了20mM GlutaMax（Gibco #35050-061）和1%HT（Gibco #11067）。细胞在37°C和98%相对湿度的8%CO2中置于轨道振动台（130 rpm）上培养。II. 使用Tempest或手动移液器进行单细胞接种用胰蛋白酶-EDTA (0.25%/0.5 mM) 收集表达黄色荧光蛋白 (YFP) 的 CHO-K1 细胞并重新悬浮在培养基中。细胞通过 40 µm 细胞过滤网 (BD Falcon #352340) 传代两次以获得没有聚集体的细胞悬浮液，然后使用血细胞计数器计数并稀释至200个细胞/mL。使用来自Formulatrix的 Tempest或手持式Matrix电子多通道移液器（Thermo Fisher #2231，12通道384均衡器移液器，2-125 µl）接种培养基和细胞。Formulatrix Tempest是一种非接触式的散装试剂分配器，可通过96个单独控制的喷嘴同时分配多达12种独立成分的任何体积。Tempest正在申请专利的微流控阀组利用正排量技术分配离散的液体体积，能够准确无误地分配到96孔、384孔和1536孔板。此外，使用标准移液器吸头作为源储液器可将死体积减少到100微升，是珍贵样品分配的最佳选择。在细胞接种之前，将25µL/孔的培养基分装到384孔板（Corning #3542）。随后以5微升/孔的细胞悬液（每种分配方法n=3）接种。将板离心以收集每个孔底部的细胞，然后孵化直到成像。III. 使用Brooks Celígo S进行单细胞接种成像使用Celígo成像细胞仪对孔板进行处理，以检测每孔单细胞和克隆生长。Brooks Celígo成像细胞仪是一种高速、易用、多通道亮场和荧光成像细胞仪，用于高通量、全孔细胞图像采集和多孔板处理。Celígo提供明 场成像和三通道荧光成像功能，用于可视化和量化烧瓶和6孔至1536孔微孔板中的细胞反应。该系统提供1µm/像素的全分辨率。整个Celígo是为明场和荧光成像而开发的，它结合了专有的光学器件和软件，可以在整个孔板一直到孔板边缘以一致的对比度对细胞进行成像和识别，这样能够识别细胞的位置和面积，而不需要额外的潜在细胞毒性荧光探针。在第0天使用双通道采集应用程序对孔板进行成像，使用荧光图像进行细胞检测，并使用明场图像对单细胞存在进行视觉验证。经过四天的培养期后，在双通道采集应用中再次对平板成像。明场成像用于确认克隆生长。IV. 活性和接种效率取决于Celígo在培养箱中过夜恢复后，比较了两种分配方法之间的活性测量。对于过夜恢复后的活性测定，将CHO细胞制备成细胞悬液，并使用Tempest 或电动移液器以每孔 500 个细胞的浓度移液到 384 孔板（Corning 3542）中。将板温育过夜。将浓度为 5µg/mL (8uM) 的 Hoechst 33342（Life Technologies，#H3570）和 2µg/mL(3uM)的碘化丙啶(PI)（Life Technologies，#P3566）加入孔中并孵育 30 分钟。使用Celígo对板进行成像和分析其活性。数据和结果I. 单细胞接种为了比较手持式电动移液器和Formulatrix Tempest之间细胞的正确分 配，对检测到单个细胞的孔数进行了量化。用电动移液器手动接种36%（3%CV）的单细胞孔板，Tempest接种32%（2%CV）的单细胞孔板（图1）。两种接种方法在单细胞接种中表现相同，无统计学差异（P，n=3）。II. 克隆生长通过在第0天和第4天对单个细胞生长为一个菌落的孔进行视觉跟踪，可以很容易地用Celígo监测克隆生长的比较。图2显示了单个细胞生长成菌落的代表性图像。细胞和菌落都可以在Celígo的明场和荧光通道中看到。这允许对手持电动移液器和Formulatrix Tempest之间的克隆生长进行量化评估，其中91%（6%CV）和91%（4%CV）的单个细胞分别生长成一个菌落（图3）。这些结果表明，两种分配细胞的方法在克隆生长方面没有统计学差异（P，n=3）。III. Celígo检测活性和接种效率对于两种接种方法，使用CHO-S细胞监测细胞活性。在一夜恢复期内，Tempest接种法的存活率测量值为97.4%（1.1%CV），电动移液器接种法的存活率测量值为98.9%（0.7%CV）（表1）。两种方法在接种后恢复得同样好。与平板上的细胞计数相比，Formulatrix Tempest的重复性更好，CV为10%，而电动手动移液器的CV为17%（表1）。IV. 手动与自动液体分配和孔板分析的对比与手动分配和孔板分析相比，自动化分配和孔板分析过程可大幅提高吞吐量。将细胞手动分配到384孔板大约需要3分钟，并且会受到更大的可变性和人为错误的影响。Tempest可以在大约40秒内将细胞有效地分配到384孔板上，节省了时间并提高了准确性。手动分析孔板以验证单个细胞的存在，这一劳动密集型过程每孔大约需要30秒，或384孔板需要192分钟，而Celigo S在大约7分钟内完成图像采集和分析过程。自动分配和分析384孔板大约需要8分钟，而手动分配和分析大约需要195分钟。因此，自动化过程将分配细胞和分析孔中是否存在单个细胞的产量提高了约25倍（图4）。总结本研究的目的是评估自动液体分配系统与基于孔板的细胞仪在单克隆细胞系开发中的使用。 要开发单克隆细胞系，必须首先分配实验孔板，然后验证每孔是否存在单个细胞。这些步骤可能既费时又费力，并且会大大增加实验费用。将 Formulatrix Tempest 液体分配器与 Brooks CeligoS 成像细胞仪相结合，创建了一个快速、高效和可靠的系统，用于分配和识别具有单细胞的孔。Formulatrix Tempest 在每块板不到 40 秒的时间内自动将细胞分配到 384 孔板，这比电动移液器分配快两分钟多。此外，使用Tempest消除了手动分配所需的材料槽和移液器吸头等材料的额外消耗成本。通过 Celígo S 自动评分对每孔细胞或菌落数量进行量化。结果分析表明，Formulatrix Tempest 将单个细胞分配到32% 的孔中，同时保持细胞活性。 与手动移液器分配和每孔单细胞分析相比，将两台机器一起使用可节省 95%以上的时间。

介绍: DNA标记/QTL（基因）发现和标记检测技术的最新进展对通过标记辅助选择对作物改良具有重大影响。为了在植物育种中发现和利用DNA标记，建立低成本、高通量、大规模、可靠和灵活的标记基因分型平台是关键因素之一。为SNP基因分型平台（如TaqMan和KASP分析）实施高通量工作流程需要准确分配检测预混液和试剂。速度和准确性是实现所需检测性能的关键因素，同时利用使试剂使用最小化的工作流程以进行大规模研究。 在此，我们展示了MANTIS仪器在我们的大豆计划中的DNA标记/QTL发现和分子育种过程中的应用。材料: MANTIS是一款易于编程、低容量、低死体积、非接触式的试剂分配器。MANTIS可以配置多达（6）种不同的试剂，分配范围为100 nL - 2 mL，可以将任何体积的试剂分配到任何孔中，并与任何密度高达1536的平板兼容。为了尽量减少死体积，试剂可以直接插入微流控芯片。通过使用移液器吸头作为加样槽，死体积可以进一步减少到6μL。这一功能非常适合分配昂贵的PCR试剂。MANTIS®的核心是一个获得专利的微流体阀组，用于测量和分配离散体积液体。压力和真空打开和关闭硅阀组上的每个阀门。每个芯片都有两个微型隔膜（100纳升/500纳升或1微升/5微升），可以以每秒10次的速度填充和分配。Mantis的整个流体路径是一次性的，以消除交叉污染风险。MANTIS®软件提供了一个易于使用、用户友好的方式来设计和运行您的检测。只需将试剂添加到分配列表中，定义体积，并在虚拟板上点选以定义您希望试剂分配的位置。MANTIS软件能够设计梯度和回填，此外还能够导入.txt和.csv的分配列表。方法: 从CX1512-44来源分离FAD3A和FAD3C基因的两个BC1F2种群。从温室种植的幼苗或田间种植的植物中收集叶子样品并排列在96孔板中。将叶样品在550°C下干燥24小时，并在管中使用带有单个BB(Daisy，Rogers AK)的GenoGrinder以1600rpm研磨2分钟。然 后从叶粉中提取DNA。TaqMan分析引物和探针使用Primer Express 3.0.1软件设计，以检测FAD3A和FAD3C (CX1512-44) 中的突变SNP。所有检测均由一对引物对扩增范围为141-167 bp的扩增子和两个分别用VIC(野生型)和FAM(突变型)染料标记的含SNP的探针组成。PCR反应在4.0µL的反应系统中进行，其中含有2µL样品DNA、2µL2×TaqMan Universal预混液(Life Technologies, Carlsbad CA)和0.2µL 5×分析混合物(每种引物的终浓度为0.255µM，每个探针的终浓度为0.05µM)。使用Mantis试剂分配器将预混液和分析混合物分配到含有样品的384孔板中。PCR后，用Tecan M1000 Pro Infinite Reader(Tecan Group Ltd，Morrisville NC)读取孔板，并将输出文件导入Kluster Caller 软件，以实现集群的可视化和SNP调用。结论: 大豆种子油的成分，特别是棕榈酸、油酸和亚麻酸，由于其营养的重要性和工业应用，对消费者来说具有巨大的利益。培育高油酸和低亚麻酸的大豆栽培品种成为重要的育种目标之一。我们开发的用于选择某些来源的有利油脂成分的SNP TaqMan标记检测在分离野生型、突变体和杂合子方面非常有效。在基因分型过程中，借助于Mantis试剂分配器，我们建立了这个基因分型工作流程，它是准确、高效和具有成本效益的。因此，该检测方法已被广泛应用于大豆育种项目，以促进脂肪酸性状的标记辅助选择，并提高了效率和精度。

会议介绍 "中国晶体学会第八届学术年会暨第七次全国会员代表大会"是由中国晶体学会主办、南昌大学和江西师范大学承办的千人大会，于2021年10月在南昌举行，期间将进行理事会、监事会换届。本次会议由大会报告、分会场报告、专题研讨、墙报交流等构成。展台我们在展台展示了我们的demo样机RockImager ，这是一款专为蛋白质结晶筛选而设计的自动化成像系统。在获取蛋白质滴的优质图像的同时能了解有关晶体的关键信息。该仪器具有各种印版容量和成像功能，因此有一个型号可以满足每个实验室的预算和工作流程。使用各种成像方法筛选条件以发现更多可见光（颜色）、交叉偏振、紫外荧光、紫外吸收、多荧光成像 (MFI)、光漂白后的荧光恢复 (FRAP)、手性晶体的二阶非线性成像 (SONICC)适合您的预算和工作流程的各种型号板容量从单板到 970 SBS 格式板或 1500 LCP 板提供温度调节选项从 30°C 到 4°C 的精确温度控制 提供多种板选项SBS、Linbro、Nextal、Terasaki/HLA 和脂质立方相 (LCP) 板