使用 Formulatrix 公司的Tempest 系统搭配 DropArray™“ 的“无壁“ 孔板进行高通量细胞测定

高效的高通量筛选是一个包含样品、化学、自动化和数据分析的复杂系统。传统的高通量系统利用6至1536孔板来支持产生可靠且具有统计学意义研究所需的大量实验条件。当前的技术需要大量投资在样品和试剂上，并且根据正在研究的细胞类型，其应用也会受到限制。

例如，多步骤处理（例如多次洗涤）的研究通常需要贴壁细胞，而悬浮细胞非常适合不需要洗涤（例如添加、混合、读取）的均质测定。在这里，我们展示了一个独特的系统，该系统将 Curiox Biosystems 的 DropArray™ 板与 Formulatrix Tempest 的非接触式、低容量自动液体分配相结合，用于自动处理贴壁细胞和悬浮细胞。

关于CURIOX BIOSYSTEMS DROPARRAY™ 微孔板

DropArray™微孔板通过利用板平面表面的疏水性和亲水性特性实现“无壁”液滴分离。以网格图案排列在疏水基底上的亲水岛使分配的液滴“聚集”并保持样品之间的分离。将液滴分配到特殊涂层的表面后，将不混溶的液体盖密封液添加到板中，以防止交叉污染和液体蒸发。有关详细信息，请参阅 http://www.curiox.com/products.html。

关于 FORMULATRIX TEMPEST

Formulatrix Tempest是一款基于专有模块化微流控芯片技术的非接触式批量试剂分配器。它可配置为通过96个单独控制的通道同时输送多达12种成分的任何体积。DropArray技术得益于Tempest液体分配器的X-Y空间精度和精确的非接触式分配功能。 Tempest获得专利的微流体阀组使用正排量将离散体积的液体分配到96、384或1536孔板，且其不可回收死体积低至50µL。可选的堆叠器和条形码阅读器为仪器增加了额外的灵活性。

FORMULATRIX

TEMPEST

方法和材料

I. 细胞系和试剂

COS-7 (非洲绿猴成纤维细胞样肾细胞) 和人类前列腺上皮 (hPRE) 细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并根据 ATCC 建议进行培养。通过使用CD8+ T 细胞分离试剂盒 (130-094-156; Miltenyi Biotec) 从随机健康供体的外周血中分离出人外周血单个核细胞 (PBMC) ，再从中纯化细胞毒性 T (CD8+ T) 细胞。

使用的抗体和染色剂如下：单克隆抗体 APC 小鼠抗人CD8（555369；BD Biosciences）、Hoechst 33342 核酸染色剂（H-3570；Molecular Probes）、鬼笔环肽-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯（P1951；Sigma-Aldrich） )、ZO-1 兔多克隆抗体 (61-7300;  Invitrogen) 和 Alexa Fluor ® 488 标记的羊抗人 IgG (H+L) 抗体(A-11013; Invitrogen)。 

抗 CD3/CD19 双特异性抗体产生于中国仓鼠卵巢细胞，并如前所述从细胞培养上清液中纯化 (1)。内吞抑制剂 Dynasore 水合物 (D7693; SigmaAldrich) 用于实时成像应用。

使用了以下细胞活性测定试剂：CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (G7570; Promega)、CellTracker™ Green CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetate) (C7025; CMFDA; Molecular Probes)、溴化乙锭溶液 (EB; E1510; Sigma-Aldrich）、吖啶橙盐酸盐水合物荧光染料（AO；318337；Sigma-Aldrich）和碘化丙啶复染剂（PI；P3566；Molecular Probes）。

II. 细胞转染

按照制造商的标准方案，通过使用FuGENE®6转染试剂（E2691；Promega）以6µL的体积：在 OPTIMEM（31985-070；Invitrogen）中稀释的(1µgDNA，用互补DNA（cDNA）转染COS-7细胞。细胞在染色前培养48小时。

III. 细胞活性测定

在进行特异性细胞活力测定之前，用不同浓度的单甲基 auristatin E (MMAE)（一种合成抗肿瘤剂）处理细胞 72 小时。对于 CellTiter-Glo® 测定，将 2 µL CellTiter-Glo® 液滴添加到 DropArray™ 板上的 2 µL 细胞液滴中。在室温下培养 5 分钟后，在 EnVision 2102 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) 上读取板。

对于基于荧光的分析，细胞用添加了 MMAE 的CellTracker™ Green CMFDA 进行标记。洗涤液滴以去除死细胞和细胞碎片，然后用 IN CELL Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences) 对板进行成像并使用 IN CELL Developer Toolbox v1.9 图像分析软件进行分析。

IV. 免疫荧光染色

细胞用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，用 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤，然后用 PBS/1% 牛血清白蛋白(BSA) 封闭 30 分钟。

将细胞与 Fc 标记的诱饵蛋白或人特异性抗体在 PBS/1% BSA 中培养 1 小时，用 1X PBS 洗涤并与适当的荧光标记的二抗在室温下培养 45 分钟，然后用 1X PBS 洗涤 并成像。

V. 自动化设备

除了 Curiox Biosystems 洗板机之外，用于处理 Curiox Biosystems DropArray™ 板的完整自动化系统还包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis 和 Peak Analysis & Automation KiNEDx 机器人的 Overlord3 调度软件。该系统通过各种免疫化学、转染和细胞活性测定来处理贴壁和悬浮细胞，减少反应体积，同时产生可靠的数据。

结果

传统384孔板 vs. DropArray™ 板

DropArray™ 无壁孔板可实现 在384 孔板上的小体积贴壁和悬浮细胞培养。覆盖 2 µL 细胞培养基液滴的培养油可避免蒸发并实现长期细胞培养条件（图 1）。

使用 DropArray™ 技术对悬浮细胞和贴壁细胞进行细胞活性测定 

使用 Tempest 和 DropArray™ 技术测试了几种细胞活性测定。使用标准 384-ul 板将反应体积减少到总共 4 µL（2 µL 细胞和 2 µL CellTiter-Glo®），而不是40 µl（20 µL 细胞和 20 µL CellTiter-Glo®），与使用CellTracker™ Green CMFDA 进行荧光活细胞染色相比，得出的半最大抑制浓度 (IC50)（图 2）非常接近。这些结果表明，与需要较大体积试剂的传统微孔板式方法相比，低体积的培养和测定条件产生了类似的结果。

图 2. 洗涤细胞（荧光检测）和不洗涤细胞（发光检测）产生类似的 IC50 曲线。

使用 DropArray™ VS微量滴定板进行细胞-表面蛋白质-蛋白质相互作用研究

DropArray™ 板在基于细胞的多步骤测定程序中的性能通过表达克隆实验进行分析，以研究 IgLON 家族成员的蛋白质-蛋白质相互作用。使用优化的洗涤条件 (2)，DropArray™ 技术与使用常规自动洗涤程序的传统 384 孔板进行了比较。用边缘系统相关膜蛋白(LSAMP) 瞬时转染 COS-7 细胞（贴壁）、人胚肾 293T (HEK-293T) 细胞（半贴壁）和HEK-293S 细胞（悬浮适应）， 人类神经营养因子 (hNT) 或阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子样 (OPCML) 构建体。

然后将表达 LSAMP、hNT 或 OPCML 的细胞与诱饵蛋白一起培养。使用 Alexa Fluor ® 488 标记的羊抗人IgG (H+L) 抗体检测 NEGR1-hFc 结合。与任一板格式的非转染细胞中的非特异性结合相比，观察到响应于 NEGR1-hFc 与 LSAMP、hNT 或 OPCML 的特异性结合，平均强度增加了 5 倍（图 3B）。

图 3. 基于细胞的细胞外蛋白质-蛋白质相互作用。(A) 用 hNT 或 OPCML 表达构建体转染的 COS-7 细胞被固定并与 NEGR1-hFc 诱饵蛋白一起培养。用抗人 AF488（绿色）洗涤和染色细胞，并用 IN Cell Analyzer 2000 扫描。在标准 384 孔微量滴定板和DropArray™ 板中使用相同的试剂进行转染和染色，以进行直接比较。通过使用核的赫斯特染色（蓝色）在两种板格式中测量相似的细胞密度。比例尺 = 70 µm。 (B) 量化了采集图像中绿色通道的平均强度。当 NEGR1-hFc 与表达 NEGR1 结合配偶体的三种不同表达构建体的三种不同细胞类型结合时，观察到类似的强度值。以标准 384 孔板形式培养的贴壁细胞系 (COS7) 产生了类似的值，但在标准 384 孔板形式的洗涤过程中去除了弱贴壁 (293T) 和悬浮适应 (293S) 细胞系。

在 384 孔板中未检测到 NEGR1-Fc 与 LSAMP、hNT 或 OPCML 转染的HEK293T或 S 细胞的结合，因为这些半贴壁和悬浮适应细胞在洗涤过程中被去除（图 3B）。然而，使用 DropArray™ 板和优化的洗涤条件处理细胞导致 NEGR1-Fc 与LSAMP、HNThNT 或 OPCML 转染的 HEK-293T 或HEK-293S 细胞结合，类似于 COS-7 细胞。

384 孔板与 DropArray™ 板每运行 40 次的体积差异

DropArray™ 板和 Tempest 液体分配器系统使转染实验中使用的大多数试剂减少了 10 倍（表 1），从而显着减少了试剂体积并显着节省了每个样品的成本。每个样本的成本降低使得完成检测的成本更低，并根据给定研究的总成本增加了可访问性。

表 1. DropArray™/Tempest 系统减少了试剂的使用量。将DropArray™ 板与 Tempest 液体分配器结合使用，可将所需的转染试剂减少 90%。

总结

高通量筛选的挑战是以最少的成本和精力有效地收集足够的可靠数据。在这里，我们提出了新的仪器和实验室用具，这些仪器和用具减少了处理贴壁和非贴壁培养细胞的同质化测定、免疫荧光测定和转染的成本和工作。利用Formulatrix Tempest和Curiox Biosystems的DropArray™板收集的数据与使用标准384孔板获得的类似数据相比更有优势，但却节省了大量的试剂，因此也节省了成本。集成自动化平台包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis和PAA KiNEDx机器人的Overlord3调度软件。这个平台提供了一个强大而可靠的系统，可以对贴壁、半贴壁和悬浮细胞进行基于细胞的测定，大幅减少试剂，同时保有传统高通量筛选板格式获得的结果质量。