在创新 HTRF 测定开发中采用低体积液体处理自动化的成本效益分析

介绍

免疫测定法的开发非常具有挑战性，这是因为获得特定信号需要正确组合样品和检测底物。

多年来，Cisbio 开发了数百种测定方法。在本应用说明中，我们将展示 MANTIS® 液体处理器及其大容量芯片更换器 (LC3) 配件如何帮助我们在以下所有关键点上改进我们的工艺：可重复性、时间、成本和减少操作者肌肉骨骼疾病。在这里，我们将重点介绍两种类型的均相时间分辨荧光 (HTRF)®检测分析：生物标志物和磷蛋白分析。 HTRF 将 TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）的荧光灵敏度、时间分辨率和低背景特性与 FRET（荧光共振能量转移）的同质性结合在一起。

图 1. MANTIS 液体处理器 和 LC3

背景知识

HTRF 使用两个荧光团，一个能量供体和一个能量受体，它们在彼此靠近时转移能量。这创建了一种同质的测定形式，其中结合和未结合的分子不需要分开，因为来自受体的荧光发射仅在分子结合时产生。

每种测定都使用夹心形式，其中两种抗体用HTRF专用荧光团标记。生物标志物检测使用两种对目标蛋白质具有特异性的抗体（参见图 2A），而磷蛋白分为两种测定方法（参见图2B）。其中第一个测定方法是磷酸化试剂盒，在试剂盒中一种抗体靶向磷酸化位点，而另一种抗体靶向整个蛋白质。

图 2A. 生物标志物测定的测定形式

图 2B. 磷酸化和总测定的测定形式

磷蛋白测定中的第二个测定方法是总测定试剂盒，它使用两种抗体靶向目标蛋白上的两个独立表位。为了获得一对功能正常的抗体配对，我们通常筛选 10 种抗体用于生物标志物测定。每种抗体都用荧光团、穴状化合物和d2标记。HTRF 供体荧光团穴状化合物由稀土配合物组成，其中嵌入了镧系离子，如铕或铽，并产生 1 至 2 毫秒范围内的长寿命发射，这是时间分辨检测的基本特征。d2 HTRF 受体由于其小尺寸和设计，在免疫竞争性测定中具有更高的稳定性，并且在某些情况下会提高测定灵敏度。

对于磷酸化蛋白分析，我们测试了五种磷酸化抗体和五种总抗体。

为了测试这些抗体配对，我们使用重组蛋白作为生物标志物，使用细胞裂解物作为磷酸化蛋白。这些样品中的每一个都被稀释两次以评估动态范围。这些稀释会在最终用户实施的培养基中进行（例如，用于分泌生物标志物的培养基，或用于细胞内磷酸蛋白的裂解缓冲液）。由于HTRF使用同质形式的一步检测实验方案，因此缓冲区组成可能对信号产生巨大影响。因此，我们开发了 4 种裂解缓冲液来匹配任何抗体对去污剂的敏感性。

讨论

在使用MANTIS之前，我们使用 384 孔板，一式三份。所有这些孔板加起来，其中1080 个孔将留给生物标志物试剂盒 ，3360 个孔留给为磷酸化/总筛选。3 到 9 号之间的微孔板编号 (见图3)。

图 3. 生物标志物和磷/总测定的抗体配对匹配

此实验设计不可能在一次操作中完成，而且最多需要 3 天才能进行一次筛选。因为多通道移液器不适合我们的操作，所以我们使用重复液体分配器完成这些操作，比如Eppendorf的Multipette。2 µL 精确分液的精度太低，板孔之间的交叉污染过多。

因此，对于单块384 孔板，需要混合三种试剂，每块板总共有 1152 次移液动作。一年后，操作者的肌肉骨骼疾病成为了我们实验室的一个真正需要正视的问题。

由于 MANTIS 能够分配到 1536 孔板形式中，因此我们能够按比例缩小 1536 孔尺寸的测定体积。

我们能够将体积从 16 µL 样品和 2 µL 每种抗体减少到 4 µL 样品和 0.5 µL 每种抗体，而不会造成任何损失。此外，由于MANTIS 分配 5 µL 比分配 4 µL 更快，我们选择了它来完成我们的实验方案。(见 图 4)

图 4. HTRF测定在信号和变异系数方面的比例缩小

所以，我们准备好了。使用 1536 孔板，一次完整的筛选只需要 1 到 3块微孔板，每块板只需大约 30 分钟即可完成分配。这个时间还包含了自动芯片清洗时间，在这段时间内用户可以自由地做其他事情。显示实验设置的磷蛋白测定示例和结果如下所示 (见 图 5)。

图 5. 磷/总测定的最佳抗体配对结果示例

总结

在一年多的工作里我们对这些改进进行了总结，这些总结包含了针对每种类型的至少十个项目，我们在许多层面上节省了时间、金钱和大量的劳动。

在使用MANTIS 之前，这些项目消耗了 130块384 孔板。通过改用 1536 孔板，我们成功将消耗的板数量减少 75%。(见 图 6A)。这一数量的板转为总共分配的44400个板孔。 每个板孔需要三次分液，总共13.32万次，这些全部由MANTIS操作完成，而非人工操作(见 图 6B)。

图 6. (A) 超过 20 个项目所使用的微孔版数量。 (B) 手动分配微孔板的数量。 (C) 所用消耗品的成本。(D) 使用的抗体量。 (E) 最佳抗体配对筛选所用的时间。

由于 MANTIS 芯片被设计成能够清洁和使用多达 100 万次分液循环，因此我们不必再担心耗材成本 (见图6C)。以前我们使用非常昂贵的重复分液器吸头，但是，当使用 MANTIS时，我们只需要一个标准吸头来处理在使用时添加到芯片中的每种试剂。我们还减少了试剂浪费，因为通常试管中的死体积可达 200 µL，但使用MANTIS，其死体积仅有 20 µL。再加上通过将 HTRF 试剂体积除以四来缩小我们的测定规模，我们节省了超过 1500 µg 的标记抗体 (见图 6D)。 

还通过在一次操作中进行全面筛选，我们估计节省了 25 天的手动工作量，这样就不必拆分操作以便由研究人员手动执行(见图6E)。手动分配需要许多控制和校正步骤，而 MANTIS 提高了可靠性，且将误差降至最低。

总之，MANTIS 正在成为我们实验室真正的游戏规则改变者。液体处理器使我们能够在各个方面改进我们的流程，考虑到一些我们熟知的不可能手动执行的操作，MANTIS会帮助到我们开辟新的可能性。