多因子培养基优化的通用自动化过程

使用Antha软件平台增强MANTIS®液体处理器的功能

为了最大限度地提高使用细胞系统生产的各种生物制剂的质量和产量，研究人员需要一直优化生长条件。这涉及操纵多种生长培养基和过程变量（因子）以确定它们如何影响质量目标产品概况 (QTPP)，并且生长条件优化实验传统上都是使用单次单因子 (OFAT) 方法。

尽管OFAT被广泛使用，但只有在所研究的变量因子不相互影响的情况下，OFAT 才真正有效。但在实际工作中，不相互影响的情况很少见。为了克服OFAT的局限性，作为一种更复杂方法的试验设计法(DoE)走上台前，研究者用它来并行研究多个因子并揭示这些因子是如何相互关联的。然而，尽管 DoE 有很多地方优于 OFAT ，但由于操作经验的缺乏和液体处理的复杂性以及速度和通量这些会立刻变化的多因子限制，它在生物技术行业的使用受到限制。

为了克服这些挑战，我们将Synthace的Antha软件平台的实验操作计划和数据管理功能与FORMULATRIX的高速自动化MANTIS®液体处理器相结合。DoE不再是一项重大挑战，研究人员现在可以有效地开展 DoE 活动。使用eGFP的生产作为一个生物产品的指标，经实验证明，一个有着12变量因子的 DoE 涉及1298次独特的实验运行和近10000 个液体处理步骤，可以在3周内仅通过3次 DoE 迭代优化生长条件，使eGFP得到 5 倍 增产。

DoE 使同时研究多个实验变量成为可能

科学实验传统上依赖于OFAT方法，即除了正在研究的因子外，实验装置中的所有内容都保持不变。这种方法的问题在于，按顺序处理不同的实验参数会阻碍研究人员看到它们之间的相互作用，这种相互作用通常发生在许多生物系统中。这可能导致为下游研究选择次优条件，并限制对所研究系统的科学洞察力。

DoE克服了OFAT 方法的局限性，能让研究人员同时研究许多不同的实验因子。这不仅增强了对所研究因子 如何在多个维度上相互作用并影响正在研究过程的理解，而且还增加了找到稳健的最佳条件的可能性（见图 1 ）。

尽管与 OFAT 相比，DoE 提供了卓越的洞察力，但它的实验执行通常不容易通过自动化实现。例如，一个典型的全因子实验按 2n 指数扩展（其中 n 是要研究的因子的数量）。在扩展方面其他更高效的设计都可能面临类似的挑战，这意味着即使可以使用自动化液体处理器，DoE 执行的实验计划也会迅速变得笨拙。

与 OFAT 实验不同，DoE 从根本上说是一种优化方法，它提供了对关键工艺参数 (CPP) 及其对生物生产过程的关键质量属性 (CQA) 的影响的理解。DoE实验的每个部分都能让实验者在他们对所研究系统的科学理解之上进行构建。

通过使研究人员能够通过使用 DoE 来利用更多的科学见解，旨在简化 DoE 实施的解决方案正在科学界得到广泛采用，因为它们为实验研究提供了更大的价值。

图 1. 单次单因子法 (OFAT) 和试验设计法(DoE) 的比较。 (A) OFAT 方法假设因子不相互作用并且最优条件是正交的，从而得到次优工艺条件。 (B) DoE 的统计框架考虑因子和正交性之间的相互作用，并更有效地探索实验设计空间，增强对过程的理解并增加找到稳健最佳条件的可能性。

将 MANTIS® 与 Antha 相结合可简化 DoE

在最近的一个案例研究中，Synthace Ltd 的研究人员将他们的 Antha 软件平台与来自Formulatrix 的高速自动化 MANTIS 液体处理器相结合，以执行复杂的多因子 (DoE) 培养基优化。本研究之所以选择使用 MANTIS 是因为其体积小——能够轻松装入生物安全柜——以及其大容量移液体积范围以及与筛选大量不同培养基组合所需的高容量 96 深孔板的先天兼容性。

使用 eGFP 的生产作为一个生物产品的指标，在 3 次 DoE 迭代中选择了 12 个因子进行研究：

• 胰蛋白胨 (2–12 g/L)

• 酵母提取物 (5–25 g/L)

• 葡萄糖 (0, 5 g/L)

• 甘油 (0, 0.65% v/v) 

• MgSO4 (0.2, 0.3 g/L)

• 氯化钠 (0, 5 g/L)

• 鼠李糖 (0.5, 3.0 mM)

• 生长温度 (25, 37°C) 

• 摇动速度 (80, 1000 rpm) 

• 接种量 (15, 30 μL) 

• 复制起点 (pBR322, pUC) 

• 收获时间 (8, 24 hours)

  
  

研究人员通过使用统计软件生成 DoE 设计文件开始研究，这些文件是精心构建的运行和条件列表，其中包含中心点、复制和对照以满足统计要求 。接下来，将设计文件上传到 Antha，其中还包含 DoE 自动化工作流程。该工作流程模拟了所有单独的液体处理步骤，因此降低了此类复杂实验的物理操作风险，如图2所示。在此之后，Antha 对 MANTIS 进行了编程，以执行 DoE 活动的第一次迭代的液体处理步骤。

图 2. Antha 中液体处理步骤的可视化模拟。在初始筛选 DoE 中，使用了 825 个液体处理步骤来设置 96 个深孔板之一。左侧的“板”是 MANTIS® 试剂架的抽象表示。在右侧，可以在模拟中的任何点选择任何孔，以检查工作流程中添加的液体。

总的来说，此处描述的 DoE 实验需要在 3 次 DoE 迭代中执行 1,298 次独特的实验运行：11 个因子用于初始筛选，4 个因子具有精细水平，3 个因子用于验证优化的介质和工艺条件。这分别相当于设置 13 个单独的 96 深孔板所需的 6660、1414 和 1717 个液体处理步骤。

Antha 控制了所有规划步骤，通过实验设置示意图引导用户选择所需的库存浓度、体积和实验室器具（参见图2）。同时，MANTIS 在及时执行实验方面发挥了关键作用，仅使用11个芯片即可分配研究中涉及的全部液体试剂。统计软件与两个平台的集成提供了一个迭代设计/测试/分析循环，以极大地简化数据分析和模型改进，如图3所示。

图 3. 迭代、自动化 DoE 的通用过程。 (A) Antha 软件平台将来自统计软件 (JMP®) 的输入转换为 MANTIS® 的液体处理说明文件。 Antha 然后汇集来自酶标仪的终点时间过程数据，并执行一套预处理步骤来清理数据集以进行即时分析，包括重复分组、空白校正、相对荧光单位 (RFU) 和光学映射 密度 (OD) 数据和基本统计数据，例如平均值、标准差和 CV。 (B) 更详细地说，包括 0 、2、 、6、8 和 24 小时的过程读数、空白、对照和细胞密度读数的 100 多个单独的读板机数据文件与 Antha 的执行运行信息相匹配，以生成 以流线型和自动化的方式校正细胞密度和相对荧光信号。

在短短 3 周内提高产量

使用 Antha 软件平台和 MANTIS 液体处理器联合执行复杂的多因子培养基优化，研究人员证明，在 3 周内仅执行 3 次 DoE 迭代，eGFP 产量就比对照增加了 5 倍（见图 4）。这一成功的基础是两个平台的易使用、具有成本效益和集成设置，可以快速确定影响生物指标 eGFP 生产的因子。

图4. 优化 12 种生长培养基因子，使 eGFP 产量在 3 周内平均增加 5 倍。定制筛选设计用于生成第一次迭代(DoE 1) 中 11 个因子对 eGFP 生产的贡献的统计概况。从 DoE 1 中确定了促成最高 eGFP 产量的关键因子，然后在第二次迭代 (DoE 2) 中进行了调整：酵母提取物和鼠李糖的接种量和浓度。 DoE 2 中的收获时间也有所不同，以探索更具经济效益的 8 小时培养是否足够。所有其他因子保持不变。 DoE 2 具有使总 eGFP 产量平均比 LB 生长培养基对照增加 2 倍的效果。第三次也是最后一次迭代 (DoE 3) 侧重于关键工艺参数：鼠李糖和葡萄糖的浓度以及多个收获点的摇动速度。总体而言，结果表明，与 LB 对照相比，eGFP 产量增加了 5 倍。

与其他 DoE 方法相比可节省大量时间

除了将 eGFP产量提高 5 倍之外，将 Antha 软件平台与 MANTIS 液体处理器一起使用还可以显著节省时间。与其他方法相比，例如将 Antha 与另一个移液机器人一起使用或在没有 Antha 的情况下使用 MANTIS 液体处理器，将 Antha 与 MANTIS 液体处理器组合使用以计划、执行和汇总3次 DoE 迭代的数据可节省74%的时间。（参见图 5）。因此，用户可以更专注于设计和对实验进行说明。

图5.与其他方法相比，Antha和MANTIS®可节省时间。将MANTIS®液体处理器和Antha软件平台结合起来，计划、执行和汇总3次DoE迭代的数据，与在使用Antha的前提下使用另一台液体处理器的或在不使用Antha的前提下使用MANTIS®相比，在96个深孔板中进行96次运行筛选DoE，可节省高达74%的时间。（预计时间基于Antha的人工实施和模拟的内部经验）。

总结

DoE在生物过程优化领域获得了广泛的关注，与OFAT方法相比具有明显的优势。然而，DoE的实施带来了一些挑战，我们认为通过结合Antha软件平台和MANTIS液体处理器可以显著减少这些挑战，如本研究所示。这种组合简化了DoE计划和执行，从根本上减少了所有流程优化组中DoE实施的障碍。现在，结合使用Antha和MANTIS简化DoE的计划和执行，减少了这些障碍。 

通过调整本案例研究中描述的通用过程，从事生物制剂发现和上游过程开发的科学家可以使用DoE统计框架对其过程进行更科学的理解：错误更少，数据处理更精简，动手时间更少，以及更快地获得科学论断。