使用桌面微流体技术实现低输入RNA-Seq样品制备的自动化和小型化

引言：

低输入RNA-Seq工作流程的试剂和反应体积的小型化和缩小，使研究人员能够在低样本输入和增加样本数 量的情况下工作。随着反应体积的减少，试剂体积的准确传递成为保持数据质量和技术重复性的关键步骤。

我们展示用于测序和Illumina Nextera®XT工作流的Clontech SMART-Seq®v4 Ultra®低输入RNA试剂盒的 小型化结果，使用紧凑的桌面微流体分配技术生成高质量的RNA- seq样本。

材料及方法：

SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒

SMART®技术(图1)是基于非模板核苷酸，当其在cDNA合成过程中达到mRNA的5 ‘端时，由基于mmlv的 逆转录酶(RT)添加。当一个特殊设计的带有与这些非模板核苷酸互补序列的SMART寡核苷酸与cDNA第一 链杂交时 ，就会发生模板切换。

RT从使用mRNA作为模板转变为使用SMART 寡核苷酸进行进一步的cDNA合成。这确保了mRNA的5‘端 被捕获，并允许特定的序列被添加到cDNA的每个端，以更简单的扩增和丰富全长cDNA。

图1.SMART cDNA合成技术。

Mantis低通芯片分配

MANTIS®是一个易于编程、低微量移液、低死腔容积、非接触式试剂分液设备。MANTIS可以配置多达24种 不同的试剂，有100nl – 2 ml的分配范围，可以分配任何体积到任何孔中，并兼容任意孔板，高达1536孔。

为了减少死死腔容积，试剂可以直接连接到微流控芯片。更可通过使用移液枪头直接插在芯片上进一步减小 死体积到只有6μL。这个功能是分配NGS样品准备试剂的理想选择。

图2. MANTIS®微流体分配系统

cDNA合成和库准备

10ng等份的小鼠大脑总RNA和等份1000个细胞(K562细胞系)和阴性对照样品使用标准全体积反应条件处 理，并与使用SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒缩小反应体积处理的样本进行对比。采用8个循环的PCR 扩增cDNA产物试剂体积如表1所示。使用片段分析仪(AATI)对生成的cDNA产物进行了表征，并通过 PicoGreen®assay进行了定量。

表1. 全反应和小型化 cDNA合成反应试剂体积。使用MANTIS低通芯片分配缓冲液、引物和预混液试剂。

使用缩减规模的反应体积的Nextera XT 片段文库试剂盒 (Illumina) )从 100 pg 等份的扩增 cDNA 产物中制备 Illumina 测序文库，如表 2 所示。与标准完整反应体积进行比较用于说明证实。小型化 Nextera XT 反应条件用于全规模和小型化 cDNA 合成样品。我们使用12个循环的PCR扩增测序文库。

表 2. Nextera XT 片段文库制备试剂体积。使用 MANTIS® 低通量芯片分配试剂。

小型化的cDNA合成和文库制备条件用于分别使用8、11、14、17个PCR周期处理1000个、100个、10个、1个 细胞样品的递减输入细胞（K562），如果样品中含有细胞，从减少的数量中扩增cDNA产物。

测序与数据分析

合并索引的样品，并使用MiSeq进行2x75 bp读数测序。用CLC Genomics Workbench（8.5.1版）对读数进 行调整，并使用CLC将其定位到rRNA和线粒体基因组。然后用CLC将未映射的读数映射到人类基因 组(hg19)和小鼠基因组(mm10)，通过RefSeq掩蔽，产生唯一的映射读数和%读数，映射到RefSeq注释， 包括外显子、内含子和基因间区域。每个文中鉴定的基因数由RPKM≥0.1的基因数确定。映射到RefSeq 后，使用CLC Genomics Workbench获得了不同基因的表达水平。

结果：

cDNA合成

图3.电泳图，显示了用于全反应和小型化反应的cDNA产物的等量分布。

表3.用Pico-Green测定测得的cDNA产物产量（ng/μl）。

测序库准备

图4.最终片段库的电泳图显示了细胞和RNA输入样本的全反应和小规模的 cDNA合成反应的等量分布。

表3.用Pico-Green测定测得的cDNA产物产量（ng /μl）。

测序结果-全反应和小型化反应的比较

表4. 全反应和小型化反应条件的RNA-Seq数据分析比较。

表5.用Pico-Green法测定cDNA产物收率(ng/Âμl)。

表6. 使用小型化样品准备条件减少细胞数量的RNA-Seq数据分析。

总结：

使用Formulaonx Mantis微流控分液系统时，使用Clontech SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒减少 用于cDNA合成的试剂量，其结果可媲美全反应体积。从按比例缩小的反应体积的工作流程扩增的cDNA的平均产量与细胞和总RNA的输入样本兼容。RNA-Seq数据分析指标在全反应和小型化反应条件之间具有可比性。高产量cDNA合成化学与高精度小剂量试剂分配相结合，提供了非常适合大规模RNA-Seq研究的工作流程。