在MANTIS平台上用SMART-Seq®v4 Ultra®低输入RNA试剂盒构建cDNA四分之一反应库进行测序

I. 目的

本实验方案的目的是描述如何在1 / 4体积反应中，使用MANTIS在96孔板上制备和组合试剂，以构建高通量SMART-Seq v4 cDNA文库。

II. 注意事项

1. 下面指定的试剂体积是使用SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒按照本方案进行测序时精确计算得出的，该试剂盒用于测序，可在三块孔板上进行96次反应，每块板四分之一体积试剂，使用单一的96反应试剂盒(634891。为了确保试剂有足够的数量进行3x96个1/4体积反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:

• LV芯片灌注体积= 5.4 μl 

• LV芯片预分配体积为=1.2 μl 

• HV芯片灌注体积=12 μl 

• HV芯片预分配体积=5 μl

  
  

1. 每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。

2. 注意避免在整个过程中出现气泡。

3. 有关SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒测序的更多信息，请参考试剂盒用户手册，可在takarabio. com/manuals获得。

III. 实验方案

A.反应缓冲液的制备

1. 使用1.5 ml微量离心管，手动分配31μl的10X裂解液。加入RNAse抑制剂1.6μl，核酸酶游离水46.5μl。然后用旋涡轻轻混合，快速旋转试剂。

B. 样品的制备

1.在不含Mg2 +和Ca2 +离子的PBS中洗涤细胞，然后将细胞分配或分选到96-孔板的各个孔中，使每个细胞悬浮于2μl不含Ca2 + / Mg2 +的PBS中（更小的悬浮体积也在接受范围内，参阅步骤3）。

2.在200ul移液器吸头中装入72.75ul反应缓冲液，然后将吸头装到LV Mantis芯片上（位置1）。对MANTIS进行编程，以从所选位置添加0.6 µl反应缓冲液。

3.可选：如果步骤1中每个单细胞悬浮液的体积小于2 ul，则用200μl无核酸酶水填充200μl移液器吸头，并将吸头装到Mantis LV芯片上（位置6）。对MANTIS进行编程，以从选定位置添加足够量的无核酸酶水，以使每个孔的总流体量达到2 µl。对于阴性对照样品，在空的孔中加入2µl无核酸酶的水。

4.在200ul 移液器吸头中装入60ul 3'SMART CDS Primer IIA，然后装到LV Mantis芯片上（位置2）。对MANTIS进行编程，以从所选位置添加0.5µl 3'SMART CDS Primer IIA（12µM）。

5. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。

C.低聚糖退火

1.将孔板从B部分转移到预热的热循环器中，并在72度下孵育3分钟。

2. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。

3. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(下方D部分)。

D.RT反应混合液的制备

1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物，使用多10％体积的试剂，以及10uL灌注体积 进行溢出反应。

2.在2,000µl的移液管吸头中加入208 ul的RT反应混合液，装到LV MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程，将1.9µl的RT反应混合液加入到选择的孔中。

3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。

E.第一链的合成

1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序 :

F.PCR扩增cDNA

1.将下列试剂在1.5uL管中冰上混合。务必在使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶。上下吹打轻轻混合。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物，使用足够进行12个溢出反应的试剂量（即总共108个反应）。

2.在1,000 ul的移液管吸头中加入810 ul的RT反应混合液，装到MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程，将7.5 µl的RT反应混合液从选择的位置加入到96孔中。

3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。

4. 将孔板转移到预热的热循环器中，然后运行以下程序：

*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:

5. PCR反应完成后，在200µl移液管吸头中加入60µl的10X裂解缓冲液，并将吸头装到LV Mantis芯片上（位置1）。用MANTIS液处理器编程，将0.3 μl的10X裂解缓冲液加入到选择的孔中。

6.如下一阶段(阶段G)所示，可以使用SPRI beads磁珠手工纯化cDNA。

G.用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA

1. 每次使用前，取磁珠等分液置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。

2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要100 μl。

3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。

4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀，然后在每个样品中加13 μl。

5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。

6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。

7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。

8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。

9.把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后，小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。

10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。

11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所有剩余的乙醇。

12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。

13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。

14. 室温孵化2分钟以补水。

15. 轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直至液体完全清澈。

16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信息标签，并在-20°C保存。