使用非接触分液系统进行高通量 Covid-19 RT-qPCR 测定

将 MANTIS® 液体处理器引入现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中提高了通量并降低了成本

全球范围的Covid-19传染导致了对大规模诊断测试的急切需求变得前所未有。在为检测和监测SARS-CoV-2 冠状病毒而开发的各种方法中，定量逆转录 PCR (RT-qPCR) 因其简单、灵敏性和可靠性而成为目前的首选方法。RT-qPCR 的另一个优势是它非常适合大规模操作，能够处理大量患者样本，而在一工作流程中可以加入自动化液体处理器。然而，由于许多自动化液体处理器有着较大的死体积和一次性吸头形式的高塑料制品要求，因此这样的实验进展可能会受到全球 RT-qPCR 试剂和自动化耗材供应短缺的限制。

牛津大学 MRC Weatherall 分子医学研究所 (WIMM) 的研究人员为了解决这个问题，最近将MANTIS® 液体处理器集成到现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。非接触式分液显著减少了移液器吸头的使用，并且高精度的小容量分液为测定小型化提供了充足的机会，MANTIS 液体处理器不仅增加了通量，而且还降低了成本。通过与约翰拉德克利夫医院的合作证明了这种应对流行病方法的价值，在此，已知的 Covid-19 阳性和阴性样本在两种情况下的一致性 > 95%。

图 1. 典型的临床测试工作流程

临床工作流程需要扩大测试规模以应对不断增长的测试需求

先收集患者拭子，然后使用 RT-qPCR 检测 RNA 病毒（图 1）的典型临床工作流程。然后将其带到封闭等级为 3 级的无尘室，之后将样品材料手动转移到含有裂解缓冲液的管中并加热以裂解细胞。接下来，在通过 RT-qPCR 扩增之前，通常使用基于移液器吸头的液体处理仪器从样品中提取 RNA。然后分析数据并将结果上传到实验室信息管理系统 (LIMS)。

尽管这样的工作流程非常有效，但应对 Covid-19 需要大规模测试。这意味着我们需要将试管更换为 96 或 384 孔板，并使用大型自动化液体处理器来提高 RNA 提取和纯化的通量。此外，我们还必须采取措施简化 RNA 测序和后续数据分析。

大型自动化液体处理器面临诸多挑战

使用大型自动化液体处理器来增加 Covid-19 RT-qPCR 工作流程的吞吐量会面临的一个主要问题是不可避免地依赖制造商提供大量一次性塑料制品，尤其是专有吸头。随着全球需求飙升造成了供应短缺，许多实验室因此无法正常工作。此外，与使用吸头相关的高死体积意味着所需试剂的获取仍然是另一个关键限制因素。

由于许多大型自动化液体处理器无法在微孔板格式之间轻松切换（例如 96 孔板到 384 孔板），在必须手动更换移液头时增加了工作流程的额外时间，因此会造成实验挑战。在涉及多种液体类别的情况下，缺乏可靠、一致的移液也会带来问题，特别是粘性试剂特别难以处理，并且通常需要重复测试，造成延误和成本增加。

非接触式分液减少了塑料制品和试剂的使用

为了克服使用大型自动化液体处理器处理患者样本带来的相关挑战，WIMM 的研究人员最近选择将 MANTIS 液体处理器（图 2）集成到现有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。他们选择MANTIS 液体处理器的一个主要原因是该系统非接触式分液的能力，即使用可重复使用的微流控芯片代替移液器吸头，以准确分配液体，而且没有交叉污染的风险。MANTIS 液体处理器的占地面积小，这使得它能放置在生物安全柜内，从而确保研究人员在处理具有潜在传染性的患者样本材料时的安全。

图 2. MANTIS® 液体处理器

MANTIS 液体处理器的其他重要特性使其特别适合 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程，包括它能够准确分配各种体积 - 从低至 100 nL 到毫升量，具有极 低死体积 ，并且可以轻松地在不同的孔板格式之间切换。结合MANTIS 液体处理器能够处理许多不同类型的液体，它的这些功能为分析小型化提供了充足的可能性，而这是在使用昂贵的试剂（例如目前PCR 缓冲液供应有限 ）时的关键考虑因素。

使用 MANTIS® 液体处理器提高 Covid-19 RT-qPCR 通量

如果要了解研究人员如何使用 MANTIS 液体处理器来提高工作流程效率，那么了解 WIMM Covid-19 RT-qPCR 测定的执行方式就显得非常重要。简而言之，qPCR 探针（来自寡核苷酸供应商的 N1 和 N2 FAM 探针，或对照探针）在 TE 缓冲液中预混合，并使用 MANTIS 分配到384 孔板中。接下来，使用 384 通道移液器将样品 RNA 添加到探针中，进行微孔板板间的直接转移。之后使用市售的 RT 酶混合物进行逆转录，接着使用合适的实时热循环仪执行qPCR（图 3）。

图 3. WIMM 高通量 COVID-19 RT-qPCR 工作流程

与手动处理相比，通过将 MANTIS 液体处理器与 384 通道移液器相结合，可以在更短的时间内设置更多数量的微孔板；实验人员使用MANTIS，可以将 qPCR 探针在 4 分钟内添加到整个 384 孔板中。通过使用更大的试剂容器（例如 50 mL 离心管）可以进一步提高通量，并且在必要时，可以通过将反应板放置在位于仪器平台上的冷却 SBS 尺寸冷却模块上来保持反应低温。

试剂分配的灵活性使测定小型化

我们与 John Radcliffe 医院合作对 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程进行了改进。此次合作的总体目标是在不影响检测灵敏度的情况下减少试剂的使用，并要求在对 John Radcliffe 临床医生所提供的已知阳性和阴性 Covid-19 患者样本材料进行验证之前先完善 RT-qPCR 工作流程。

最初，WIMM 研究人员评估了检测量减少所造成的影响。在早期测试数据（图 4）中可以看出，在单重测定格式中将 N1 和 N2 预混液的体积从 15 µL 减半至 7.5 µL 对灵敏度没有产生不利影响；在这两种情况下，该检测方法几乎都能检测到一个 Covid-19 RNA 拷贝。

接下来，通过将 N2 探针与 Cy5 标记的对照探针（图 4）组合来评估 RT-qPCR 测定对多重测定的适用性，其中单独使用 N2 探针或与 Cy5 标记的对照探针组合生成标准曲线再次证明测定灵敏度没有明显变化。

在这些实验成功之后，WIMM 研究人员使用修订后的实验方案对来自 96 个已知 Covid-19 状态的鼻咽拭子样本中的纯化 RNA 进行盲测。所有测试水平的结果都表明两个情况之间的一致性 > 95%，并且所有阴性样本都是非反应性的。

图 4. 在全体积和半体积下进行的 N1 和 N2 单重测定显示出相似的灵敏度

使用MANTIS® 液体处理器完善了工作流程，这已得到验证

通过将 MANTIS 液体处理器集成到 Covid-19 RT-qPCR 的现有工作流程中，一致且可靠的非接触式分液提高了通量并消除了对制造商专有吸头的依赖——这意味着全球供应短缺不再是阻止 RT-qPCR 测定以所需容量运行的障碍。MANTIS液体处理器在减少检测量、显著节省成本以及在试剂短缺时避免延误等方面也发挥了关键作用。最后，MANTIS 液体处理器通过处理多重测定所需的复杂移液操作，确保即使是那些没有使用自动化液体处理器经验的人也可以轻松地进行多因子 RT-qPCR 实验。